大气细颗粒物对A549细胞炎性因子分泌

【摘要】  目的 探讨大气沙尘与非沙尘天气细颗粒物(PM25)对人肺腺癌上皮细胞炎性因子分泌的影响。方法 沙尘与非沙尘细颗粒物采自甘肃省武威市；实验细胞为人肺腺癌上皮A549细胞(A549细胞)。分别用25，50，100，200?μg/ml沙尘与非沙尘细颗粒物对A549细胞进行染毒，染毒24?h后，细胞计数法测定细胞毒性。收集细胞上清，用放射免疫法测定细胞因子白介素8(IL8)和肿瘤坏死因子-α(TNFα)的浓度。结果 (1)沙尘细颗粒物对A549细胞作用24 h后，在细胞毒性上表现出低浓度促进细胞增殖，高浓度抑制增殖现象；非沙尘颗粒物随染毒剂量增加，细胞存活率明显降低，抑制细胞增殖。(2)沙尘、非沙尘细颗粒物对A549细胞作用24?h后，均可促进A549细胞分泌炎性因子IL8。(3)沙尘、非沙尘颗粒物对A549细胞作用24?h后，对TNFα分泌的影响不明显。结论 沙尘与非沙尘细颗粒物均有早期炎症效应。

【关键词】  沙尘暴 大气细颗粒物 细胞因子 A549细胞

Study on effects of fine particulate matter on secretion of inflammatory factors in A549 cells

　　CHEN Wei,GUO Xinbiao,DENG Furong,et al.

　　Departemtn of Occupational and Environmental Health Sciences,Health Science Center,Peking University(Beijing 100083)

    Abstract： ob[x]jective  To study the effects of PM25 collected in duststorm and normal weather days on the secretion of interleukin8(IL8) and tumor necrosis factorα(TNFα) human lung adenocarcinoma A549 cells (A549 cells).Methods  PM2.5 was collected during duststorm and normal weather days in Wuwei,a city of Gansu province.A549 cells were exposed to PM2.5 at the doses of 25,50,100,200 μg/ml,respectively.After 24 hours,cytotoxicity of the PM2.5 was measured by cell number counting.The levels of IL8 and TNFα were measured using radioimmunity assay.Results  PM2.5 collected in duststorm increased the proliferation of A549 cells at low doses while inhibited it at high doses.PM2.5 collected in duststorm and normal weather days,however,inhibited at the tested concentrations.Both kind of PM2.5 increased the secretion of IL8.However,there were no significant changes in the secretion of TNFα from cells treated by both kind of PM2.5.Conclusion  PM2.5 from the sandstorm dust and non-sandstorm dust could induce the early inflammatory reaction in the A549 cells.
   
　　Key words： duststorm;fine partiular matter(PM25);cytokine;A549 cells

　　沙尘暴对人群健康危害严重，尤其是对呼吸系统的危害大。而沙尘暴对健康的影响在很大程度上取决于其中的细颗粒物(PM2.5)〔1〕。国内外流行病学研究发现，PM2.5污染与人群呼吸和心血管等系统疾病的死亡率和患病率增加呈显著相关〔2-5〕。颗粒物进入呼吸道在肺内沉积，所携带的主要污染物质释放到肺泡表面，并终与肺泡上皮接触。肺泡上皮细胞在一系列颗粒物所致的疾病中扮演重要的角色。Hetland R B〔6〕研究认为，矿物颗粒物的金属成分可引起人肺腺癌上皮A549细胞产生细胞因子白介素(IL6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)。Aust等〔7〕研究发现，PM2.5中的过渡金属成分引起A549细胞氧化应激并释放炎性介质。张文丽等〔8〕对我国北京和太原两城市的研究中发现，PM2.5全颗粒物成分可导致A549细胞分泌炎性因子IL6和TNFα。本文采用放射免疫法方法，以细胞因子白介素8(IL8)和TNFα为指标，研究沙尘与非沙尘PM2.5对A549细胞炎性因子分泌的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  主要试剂及仪器

　　1.1.1  主要试剂

　　PMI1640培养基(美国Gibco公司)；胰蛋白酶(美国Sigma公司)；胎牛血清(天津市财慧生化制品厂)；四甲基偶氮噻唑蓝(美国Sigma公司)，异丙醇(分析纯)。

　　1.1.2  仪器G1200型大流量采样器(美国Andersen公司)，Alpha24冷冻干燥机(德国Christ公司)，BioRed550型酶联免疫检测仪(美国(BioRed公司)，SN695型放免测量仪(上海核辐光电仪器有限公司)。

　　1.2  方法

　　1.2.1  颗粒物样品的采集

　　采样地点位于甘肃省武威市某城区，采样仪器距离地面约10?m，周围人口密集，树木较少无重大污染源。采样时间为2002年春季3～5月。采用G1200型大流量采样器24 h连续采样，采样流量为1 m3/min，以QMA型石英纤维滤膜收集颗粒物，采好颗粒物的滤膜用铝箔纸包好。采集的样品由北京大学环境学院胡敏教授提供。

    根据当地气象部门和环保监测站资料，结合国家《环境空气质量标准》)(GB30951996)，样品分为2类，采自正常良好天气(晴朗天气且PM2.5、SO2、氮氧化物均未超标)的称为非沙尘PM2.5，采自沙尘暴天气的称为沙尘PM2.5。

　　1.2.2  颗粒物的处理

　　将载有样品的石英纤维滤膜放入去离子水中，超声振荡提取20?min以洗脱颗粒物，然后将样品低温干燥24?h，称重，磷酸盐缓冲液(PBS)配制成不同浓度总颗粒物悬液，-20℃避光保存。

　　1.3  细胞培养及染毒
 
　　A549细胞(美国纽约大学曲青山教授惠赠)。用0.25%胰酶消化对数生长期的细胞，用含10%胎牛血清的1640培养液，将细胞密度调为2×105/ml接种于24孔培养板，每孔加细胞悬液1?ml，培养24?h后用PBS液冲洗2次，加入总颗粒物悬液染毒20?μl，使终浓度分别为25，50，100，200?μg/ml，设置空白对照，细胞毒性实验每染毒剂量设5个平行样，细胞因子实验每染毒剂量设8个平行样。37℃、5%CO２培养24?h。

　　1.4  细胞计数法测定细胞毒性

　　24孔板细胞染毒24?h后，收集上清液，PBS冲洗孔2遍，加入适量0.25%胰酶消化细胞，加入1?ml PBS吹打混匀细胞，取100?μl细胞悬液加入同体积台盼蓝染液，混匀，用细胞计数板进行细胞计数。每个浓度每个平行样皆作相同处理。

　　1.5  炎性因子的测定

　　IL8和TNFα的测定均采用放射免疫法，放免试剂盒(中国人民解放军总医院科技开发中心放免研究所)。

    细胞培养及染毒方法见1.3，1.4。染毒24 h后，取上清移入放免管中，根据试剂盒所述方法进行测定。

　　1.6  统计分析

　　采用Excel和SPSS 11.0软件进行，各组间差异采用方差分析(ANOVA)进行显著性检验，均数间多重比较用小极差法(LDS)。

　　2  结  果

　　2.1  沙尘、非沙尘PM2.5对A549细胞的毒性
 
　　沙尘PM2.5作用于A549细胞24?h，25?μg/ml组细胞存活率(129%)高于对照组()，表现为细胞的增殖；随染毒剂量增加，细胞存活率下降；200?μg/ml组细胞存活率(61%)显著低于对照组。非沙尘PM2.5作用A549细胞24?h后，随染毒剂量增加，细胞存活率下降，依次为，81%，82%和89%。

　　2.2  沙尘、非沙尘PM2.5对人肺上皮细胞A549分泌细胞因子IL8的影响(图1)

　　沙尘与非沙尘PM2.5均引起IL8分泌增加，且浓度在50?μg/ml时IL8分泌［沙尘为(4.556±0.841)ng/ml，非沙尘为(3.697±0.266)ng/ml］较对照组［（2.464±0.761）ng/ml］有明显促进作用。说明沙尘与非沙尘PM2.5有明显的促进A549分泌IL8的能力。而且浓度在50?μg/ml时沙尘对A549的促进作用明显强于非沙尘。
注：染毒时间为24?h，样本量n=8。对照组比较，a P＜0.01；与相同浓度的沙尘PM2.5比较，b P＜0.05

　　2.3  沙尘、非沙尘PM2.5对人肺上皮细胞A549细胞因子TNFα的影响(图2)

　　与对照组比较，沙尘与非沙尘PM2.5均未引起A549细胞分泌TNFα的明显改变。

　　3  讨  论

    本实验结果表明，染毒24?h后，沙尘PM2.5对A549细胞的毒性作用表现为低剂量促进增殖，高剂量抑制增殖，且呈现剂量依赖关系；而非沙尘PM2.5对A549细胞的毒性作用表现为低剂量增殖的特点。二者不同结果可能与PM2.5的理化组成不同有关。沙尘暴颗粒物成分受自然来源的影响大而受人为来源的影响相对小，有机成分明显少于非沙尘颗粒，而无机物含量则明显高于非沙尘颗粒物〔9〕。本研究测定非沙尘暴注：染毒时间为24 h，样本量n=8PM2.5中有机成分约占总颗粒物50%，而沙尘暴PM2.5中有机成分仅占总颗粒物30%。因此，沙尘暴颗粒物在来源、理化组成方面有其特殊性，生物学效应与其他颗粒物可能不完全一致。

    细胞炎性因子实验结果表明，沙尘、非沙尘细颗粒物PM2.5均可刺激A549细胞合成释放IL8炎性因子，但二者对TNFα的影响不明显。说明沙尘、非沙尘细颗粒物对机体具有潜在炎性损伤毒性，且能启动早期炎症反应。TNFα除具有炎性介质作用外，也可作为各种细胞因子(如IL8等)的启动因子〔１０〕。本次实验选取染毒时间为24?h，在此时间点TNFα可能已发挥完作用而恢复正常，而后诱发的IL8正在发挥其炎性的作用，故结果显示，在染毒沙尘与非沙尘细颗粒物24 h后，A549细胞分泌IL8增加，而TNFα水平未见明显异常。因此，在今后的研究中可选取不同染毒时间对大气细颗粒物炎性作用机制进行探讨。

【参考文献】
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作者：陈威 郭新彪 邓芙蓉 林薇薇

作者单位：北京大学医学部劳动卫生与环境卫生学系，北京 100083