鸡蛋中代谢物液相色谱-串联质谱联用测定

【摘要】  目的 建立测定鸡蛋中二甲硝咪唑及其羟基代谢物的高效液相色谱-串联质谱法。方法 样品加入氘代内标，经乙酸乙酯提取，氮气吹干，再用0.1%甲酸-正己烷(1+1)溶解残渣，水相过滤后，电喷雾离子化(ESI+)，多反应监测模式定量。结果 方法线性好，二甲硝咪唑及其羟基化代谢物的线性范围分别为0.03～50 μg/L,0.11～50 μg/L；线性相关系数分别为0.998 9，0.999 6，检出限为0.009 μg/kg，0.03 μg/kg；在1，4，10 μg/kg 3个浓度水平加标，二甲硝咪唑的回收率在90.4%～98.5%之间，变异系数CV<4.4%，代谢物的回收率在85.2%～102.5%之间，CV<5.6%。结论 方法灵敏度高、准确度好，能满足鸡蛋中准确定性、定量要求，为二甲硝咪唑的溯源调查和卫生监督提供了科学依据。

【关键词】  二甲硝咪唑；羟基代谢物；鸡蛋；液相色谱-串联质谱法

　　Determination of dimetridazole and its hydroxylated me[x]tabolite in eggs using liquid chromatography-tandem mass spectrometry

　　LIU Guihua,LIU Honghe,MAO Lisha,et al.

　　Shenzhen Municipal Center for Disease Control and Prevention(Shenzhen 518020,China)

    Abstract： ob[x]jective  A liquid chromatographytandem mass spectrometry(LC-MS/MS) method was developed to quantify and confirm the presence of dimetridazole(DMZ) and its hydroxylated me[x]tabolite DMZOH in eggs.Methods  Deuteriated DMZ was employed as an internal standard.Samples were extracted with ethyl acetate,then evaporate just to dryness under nitrogen.The residue was redissolved in 0.1% formic acidhexane(1+1,v/v),formic acid phase was used for analysis.Quantitative results were ba[x]sed on multiple reaction monitoring mode after ionization in the positive electrospray ionization mode.Results  The calibration curve of DMZ and DMZOH showed good linearity in the range of 0.03～50 μg/L with correlation coefficient of 0.998 9 and the range of 0.11～50 μg/L with r=0.999 6 respectively.The detection limits were 0.009 μg/kg and 0.03 μg/kg.The average recoveries at three spiked levels(1,4,10 μg/kg) were between 90.4% and 98.5% within CV<4.4% for DMZ,and between 85.2% and 102.5% within CV<5.6% for DMZOH.Conclusion  The method can identify and quantify DMZ and its me[x]tabolite DMZOH in eggs.It is simple and sensitive,suitable for statutory residue testing.

    Key words： dimetridazole;hydroxylated me[x]tabolite;eggs;LC-MS/MS

　　二甲硝咪唑（DMZ）对家禽黑头病的治疗有，然而其潜在的致癌性，使其成为在食源性动物中明令禁用和重点监控的兽药品种。目前，在黑头病的治疗方面尚未找到更好的替代药，违禁使用的案例时有发生。由于DMZ代谢极快，停药２?d后组织中已无法检测到残留，但鸡蛋却不同〔1〕。RM Aerts〔2〕报道，鸡经口染毒75?mg DMZ，1?d后在蛋中可检测到药物，且残留物持续长达8?d以上。为此，我们利用高效液相色谱－串联质谱联用法（LC-MS/MS）特有的选择性和高灵敏度，建立了LC-MS/MS测定鸡蛋中DMZ及其代谢标志物2-羟甲基-1-甲基-5硝基咪唑（DMZOH）〔3〕的确证方法，样品处理简单，以内标法定量,方法准确可靠，能满足低浓度样品的定性、定量要求，适合违禁兽药滥用的监控。

　　1  材料与方法

　　1.1  仪器

　　Agilent 1100 液相色谱仪（美国Agilent公司）；API 3000串联三级四极杆质谱仪（美国应用生物系统公司）；Allegra 64R 高速冷冻离心机（美国Beckman Coulter公司）；T-25匀浆机（德国IKA公司）；超声波发生器；旋涡混合器；氮气吹扫仪；0.45?μm水系针筒式微孔滤膜过滤器。

　　1.2  标准与试剂

　　DMZ纯度>99.0%，（德国 Sigma-Aldrich公司）；DMZOH纯度>99.0%，（德国Merck公司）；氘代内标为d3-DMZ（德国 WTTEGA Laboratorien公司），分别用甲醇配制成1?mg/ml的储备液；混合标准中间液：分别吸取适量DMZ和DMZOH储备液于容量瓶中，用甲醇稀释成1?μg/ml；内标中间液：吸取适量d3-DMZ储备液于容量瓶中，用甲醇稀释成1?μg/ml。所有标准避光保存于4℃冰箱中。甲醇、乙酸乙酯为色谱纯（Merck）；甲酸等均为分析纯；实验用水为二次蒸馏超纯水。

　　1.3  实验方法

　　1.3.1  液相色谱参数

　　流动相：甲醇（含0.1％甲酸）-0.1％甲酸水（40+60，v/v）；色谱柱：Atlantis C18，5?μm，2.1?mm×150?mm；柱温：30℃；流速：0.20?ml/min；进样20?μl。

　　1.3.2  质谱参数

　　离子源为阳离子电喷雾电离模式（ESI+)，检测方式为多反应监测（MRM）方式，喷雾电压5500?V；离子源温度450℃；雾化气压力11?psi；气帘气压力8?psi；辅助气70?L/min；聚焦电压与入口电压分别为300?V、10?V。MRM参数见表1。表1  多反应监测的MRM参数（略）

　　1.3.3  样品处理

　　准确称取（5.0±0.01）g已去壳均浆的鸡蛋样品，置于50?ml离心管中，添入20?μl混合内标标准溶液（浓度为1?μg/ml），混匀，放置15?min，加入10?ml乙酸乙酯溶剂，超声5?min，4?000?r/min离心15?min，上清液转入试管中，下层残渣加人10?ml乙酸乙酯，重复提取１次，合并上清液,45℃氮吹至近干。加入1?ml正己烷和1?ml 0.1%甲酸震摇溶解残渣，再2?000?r/min离心10?min，弃去正己烷层，将余下的甲酸萃取液过0.45?μm微孔滤膜，滤液供Lc-MS/MS测定。

　　1.3.4  质谱和色谱条件优化
 
　　由于DMZ为碱性兽药，采用ESI＋电离模式效果好。利用针泵直接进样，观察DMZ、DMZOH母离子［M+H］+，然后分别找出其对应的信号较强的2～3个子离子，组成母离子与子离子监测离子对。而其他离子对则作为定性辅助离子对。液相色谱分离条件选择时，分别检验了乙腈和甲醇，甲醇的背景信号值更低，更适合于分析。由于ESI+模式下，流动相中加入甲酸可提高DMZ和DMZOH的离子化效率，实验选用在水相与有机相中均加入0.1％甲酸，MRM监测不需要色谱的完全分离，实验选择甲醇（含0.1％甲酸）－0.1％甲酸水（40+60，v/v）等度洗脱，以减少柱子的平衡时间，保留时间分别在3.7?min，3.0?min。

　　1.3.5  定性分析标准

　　按欧盟2002/675/EC指令规定的要求〔４〕，本实验采用串联质谱法监测MRM5个离子对，DMZ与DMZOH均具有1个母离子及2个子离子，完全满足上述要求。对可疑阳性样品，依据（１）保留时间；（２）定性离子对与定量离子对的相对丰度比进行判断。要求样品的保留时间与标准的平均保留时间之相对偏差在±2％以内；样品的2个离子对的相对丰度比值与标准的离子对的丰度比值之偏差不超过±20%。

　　1.3.6  定量测定

　　样品依照本法处理后，Lc-MS/MS测定，采用内标标准曲线法定量，结果按下式计算：Cx=CsW；Cx样品中DMZ或DMZOH浓度，μg/kg；Cs：标准曲线中得到的DMZ或DMZOH浓度，μg/L；W：样品重量g。如果样品浓度超过线性范围的上线浓度50?μg/L，则应适当稀释至线性范围内重新测定。

　　2  结  果

　　2.1  鸡蛋样品中加标ＭＲＭ色谱分析（图1）

　　2.2  标准工作曲线

　　分别准确吸取0，10，50，100，200，500?μL混合标准中间液（1?μg/ml），置于6个10?ml容量瓶中，加入1?μg/ml内标中间液20?μl，用0.1％甲酸水溶液定容至刻度，配制标准工作系列。采用内标法定量，以标准峰面积与d3-DMZ内标峰面积比值为纵坐标，以标准浓度为横坐标绘制标准曲线，DMZ、DMZOH的线性回归曲线分别为：Y＝0.16X＋0.00875，r=0.9989；Y＝0.0517X＋0.0679，r=0.9996，相关系数r>0.998，显示线性良好。线性范围DMZ为0.03～50?μg/L；DMZOH为0.11～50?μg/L。

　　2.3  方法的回收率及精密度

　　实验通过向空白鸡蛋样品中分别添加3个浓度水平1，4和10?μg/kg的标准，每一个添加水平包括6个重复样品，提取和测定按实验方法。结果显示，DMZ的回收率为90.4%～98.5％，变异系数CV<4.4％；DMZOH的回收率为85.2%～102.5％，CV<5.6％，表明方法的准确度和精密度良好。

　　2.4  方法检出限及定量限(图2)

　　对鸡蛋加标样品进行检测，DMZ浓度为0.25?μg/kg，DMZOH浓度为1?μg/kg，定量检测离子对的信噪比（S/N）检出限（LOD）按信噪比3:1计算，得到DMZ、DMZOH的LOD分别为0.009，0.034?μg/kg。定量限（LOQ）信噪比按10：1计算，得到其对应的LOQ分别为0.03,0.11?μg/kg，方法灵敏度衡高，可满足极低含量的药物残留检测需求。

　　3  讨  论

    本法采取乙酸乙酯提取样品、正己烷脱脂、0.1％甲酸水溶液溶解效果好，回收率高，DMZ、DMZOH回收率达到90.4%～98.5%与85.2%～102.5％,与乙腈提取液比较，有显著提高。文献报道〔5〕，鸡蛋中DMZOH的回收率为62.2%～86.7％，DMZ为73.6%～81.2％，而且乙酸乙酯挥发性好，容易挥干，可以大大节省有机溶剂挥干时间。

    在样品的处理方面，与Mortierl〔６〕和Mortier P〔７〕的研究方法比较，省去了固相萃取净化步骤。用正己烷萃取可以除去非极性脂肪，降低基质对残留物的测定影响，方法不仅简单、快捷，同时节约了成本。

    以鸡蛋作为分析样本，避免了因药物代谢速度过快在鸡肉中无法检测的问题。利用串联质谱法MRM测量的选择性，建立了Lc-MS/MS测定鸡蛋中DMZ及其代谢标志物DMZOH的方法，方法灵敏度高，检出限可低至0.009与0.03?μg/kg，以内标法定量,准确可靠，能满足禁用物质定性、定量要求。为有效保障食品安全，开展药物调查溯源和卫生监督提供科学依据。

【参考文献】
  　　〔1〕Cannavan A,Kennedy DG.Determination of dimetridazole in poultry tissues and eggs using liquid chromatography-thermospray mass spectrometry［J］.Analyst,1997,122(9):963-966.

　　〔２〕Aerts R M,Egberink I M,Kan C A,et al.Liquid chromatographic multicomponent method for determination of residues of ipronidazole,ronidazole,and dimetridazole and some relevant me[x]tabolites in eggs,plasma,and faeces and its use in depletion studies in laying hens［J］.J Assoc Off Anal Chem,1991,74(1):46-55.

　　〔３〕姜杰，刘桂华，何彩,等.鸡肉组织中二甲硝咪唑残留物测定［J］.中国公共卫生，2006，22（4）：319-320.

　　〔４〕ECC（欧盟）.Commission Decision 2002/675/EC Off［D］.J Eur commun,2002,221(8):134.

　　〔５〕Xiao X,Li XW,Shen,JE,et al.Determination of four nitroimidazole in poultry and swine muscle and eggs by liquid chromatography/tandem mass spectrometry［J］.Drugs Cosmetics Forensic Science,2006,89(1):94-99.

　　〔６〕Mortier L,Daeseleire E,Peteghem C V.Liquid chromatographic tandem mass spectrometric determination of five coccidiostats in poultry eggs and feed ［J］.J Chromatogr B,2005,820：261-270.

　　〔７〕Mortier P,Hure I,Gremaud E,et al.Analysis of four 5-nitroimidazole and their corresponding hydroxylated me[x]tabolites in egg,processed egg,and chicken meat by isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry［J］.J Agric Food Chem,2006,54(6):2018-2026.

作者：刘桂华，刘红河，毛丽莎，张红宇，陈卫

作者单位：深圳市疾病预防控制中心，518020