G-CSF预处理对家兔心肌缺血/再灌注损伤的影响

作者：张青卿，夏勇，李东野

作者单位：1.徐州医学院附属医院急救中心，江苏徐州221002；2.徐州医学院附属医院心内科

【摘要】  目的 探讨粒细胞集落刺激因子(G-CSF)预处理对心肌缺血/再灌注损伤的影响机制。方法 25只健康家兔，随机分为3组：假手术对照组（Sham组，n=8），生理盐水组（NS组，n=9）,G-CSF组（n=8）。Sham组开胸后心肌动脉只穿线不结扎；G-CSF组于术前连续5天皮下注射G-CSF 10 μg·kg-1·d-11；NS组皮下注射生理盐水0.5 ml每日1次，连续5天；使用开胸法建立缺血/再灌注动物模型，光镜下观察各实验形态学改变，计数缺血区周边部毛细血管数量，免疫组化观察各组Bax、Bcl-2凋亡相关蛋白的表达，比较各组心肌细胞凋亡的程度。模型制备成功后，MacLab生理记录仪测定再灌注后左心室发展压(LVDP)及左心室内压大上升和下降速率（+dp/dtmax）,比较各组间心功能差异。结果 G-CSF组及NS组心功能均较Sham组下降(P﹤0.01)，但G-CSF组心功能优于NS组（P﹤0.01）。G-CSF组缺血区周边部毛细血管计数高于NS组及Sham组(P﹤0.01)。G-CSF组Bcl-2明显高于NS组（P﹤0.01）,Bax则明显低于NS组（P<0.01）。结论 ①G-CSF可以改善缺血/再灌注家兔的心功能;②G-CSF能够上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，同时抑制了促凋亡蛋白Bax的表达，减少了缺血急性期心肌细胞的凋亡;③G-CSF能够改善缺血心肌细胞的微循环，增加缺血区周边部毛细血管密度。

【关键词】  缺血/再灌注损伤；心肌；粒细胞集落刺激因子；毛细血管密度

　　Effect of granulocyte colony-stimulating factor preconditioning on myocardial ischemia/reperfusion injury in rabbits

　　ZHANG Qingqing, XIA Yong, LI Dongye

　　1.Emergency Center, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China;

　　2.Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College

    Abstract: ob[x]jective  To investigate the mechanism of granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) preconditioning on myocardial ischemia/reperfusion (I/R) injury. Methods  25 healthy rabbits were randomly divided into three groups: (1) sham operation group (Sham group, n=8); opening the chest, with only threading under cardiac artery and without ligation. (2) NS group (n=9), subcutaneous injection of 0.5 ml normal saline for 5 days before I/R; (3) G-CSF group (n=8): subcutaneous injection of G-CSF (10 μg ·kg-1·d-1 for 5 days before I/R). After the animal model of I/R was established for observation of morphological changes and the capillary count with light microscopy and the ex[x]pression of apoptosis-related proteins Bax and Bcl-2 with immunohistochemistry to compare the myocyte apoptosis in each group. After the animal model was prepared, the post-reperfusion LVDP and +dp/dtmax were determined by MacLab physiological recorder to compare the cardiac functional differences between each group.  Results  (1)Cardiac function in both NS group and G-CSF group was lower than that in Sham group (P<0.01), but was higher than in NS group (P<0.01). (2) The capillary count was higher in all the treatment groups with G-CSF than in NS group and the Sham group (P<0.01). (3) In the G-CSF group the ex[x]pression of Bcl-2 protein was higher than that in the NS group and the Sham group(P<0.01), whereas the ex[x]pression of Bax was markedly lower in G-CSF group than in the NS group(P<0.01). Conclusion  (1) G-CSF could enhance cardiac function of rabbit after I/R injury. (2) G-CSF could upregulate the ex[x]pression of the anti-apoptosis protein Bcl-2 and meanwhile restrain the ex[x]pression of pro-apoptosis protein Bax, and decrease the myocyte apoptosis of acute ischemia. the extent of myocardial apoptosis in ischemia and reperfusion injury. (3) G-CSF could improve the microcirculation of ischemic myocytes and increase the density of peripheral capillaries in ischemic areas.

    Key words: ischemia/reperfusion injury; myocardia; granulocyte colony-stimulating factor; density of capillary

    粒细胞集落刺激因子（G-CSF）是一种相对分子质量约19000的糖蛋白［1］，是一种调节中性粒细胞产生的多肽生长因子。G-CSF的主要作用是促进中性粒细胞的成熟并抑制中性粒细胞凋亡，是白细胞强有力的动员剂。临床主要用于急性粒细胞缺乏症，以及化疗后改善骨髓抑制。同时它还能够动员骨髓中CD34+的干细胞进入外周血。基于对干细胞治疗心肌梗死的浓厚兴趣，G-CSF、干细胞刺激因子（SCF）等造血因子治疗心肌梗死的实验及临床研究成为近年来的热点。这些研究多集中于急性心肌梗死以及梗死后的心力衰竭方面，而使用G-CSF预处理，观察G-CSF对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用鲜有报道。2006年Takahama等［2］首先研究了心肌缺血90 min，再灌注6 h，再灌注开始的时候静脉应用G-CSF 30 min，研究发现，G-CSF缩小了心肌梗死的面积，降低了室颤的发生率，同时没有改变髓过氧化物酶的活性。在该研究中，G-CSF的应用始于再灌注开始之时，此时对白细胞的动员和活化并不充分。G-CSF一方面能够明显上调中性粒细胞的数量，增强呼吸爆发及炎症细胞的趋化［3-4］。而中性粒细胞的活化又在缺血后的再灌注当中扮演了重要的角色。再灌注后的炎症反应同时也是梗死面积延展的罪魁祸首，但G-CSF另一方面表现出了抑制细胞凋亡的特性。因此使用G-CSF预处理在心肌缺血/再灌注损伤当中究竟扮演了什么样的角色是值得研究的。本文重点研究G-CSF预处理对兔心肌缺血/再灌注后心肌细胞凋亡蛋白Bax及Bcl-2的表达以及心功能的影响。

　　1  材料和方法

　　1.1  实验动物 

　　清洁级新西兰纯种健康大耳白兔30只，体重2.3～2.7 kg，雌雄不拘，由徐州医学院实验动物中心提供。实验中5只动物死亡，完成实验的动物共25只。

　　1.2  主要药品、试剂与仪器 

　　重组人G-CSF（rhG-CSF，杭州九源基因工程有限公司），细胞凋亡检测试剂盒、兔抗-Bcl-2、兔抗-Bax （武汉博士德生物工程有限公司）。血细胞自动分析仪 （日本SysmaxKx-21），MacLab生理记录仪 （美国GE公司），图像分析仪 （瑞士LeicA公司）。

　　1.3  实验分组及给药 

　　25只健康大耳白兔，随机分为3组。①假手术对照组（Sham组，n=8），左心室支远端穿过缝线不结扎；②生理盐水组（NS组，n=9）,生理盐水0.5 ml皮下注射每日1次，连续5天，第5天制备缺血/再灌注动物模型；③G-CSF组（n=8），G-CSF 10   μg·kg-1·d-1连续5天皮下注射，第5天制备动物模型。

　　1.4  动物模型的制备 

　　1.5%的戊巴比妥钠（30 mg·kg-1）静脉麻醉后，连接MacLab生理记录仪行心电监护及再灌注后心功能检测。 沿胸骨正中切开皮肤，暴露心脏，分离心包，暴露左心室支中下三分之一，以持针器持5-0的缝合针线绕过左心室支远端，用一内径为1.5～2.0 mm的鲁美尔管套出两端线头，收紧线头阻断左心室支远端血流，止血钳夹紧固定，观察缺血区域心肌组织颜色变淡，运动减弱，同时MacLab生理记录仪显示Ⅱ导联ST段持续抬高超过0.1 mV，30 min后松开止血钳，再灌注90 min。假手术组穿线后旷置120 min。

　　1.5  血常规的检验 

　　在用药之前及用药之后（制备模型之前）分别抽取耳缘静脉血2 ml置于抗凝管内送检。

　　1.6  心功能的检测 

　　实验动物在再灌注结束后连接压力转换器，测压管内液体加入肝素抗凝，调零，于左心室正前方心尖处垂直进针，插入左心室3～8 mm,勿太深，以防损伤心肌及心室内结构。当导管内出现血液搏动，则认为进入左心室，停止进针，打开三相开关阀门，记录左心室压力曲线、左心室发展压（LVDP）及左心室内压大上升/下降速率（+dp/dtmax）。

　　1.7  标本的取材和处理 

　　心肌缺血/再灌注之后，完成心功能的测定，离断大血管，取出心脏，冰生理盐水冲洗，垂直于左心室长轴环形切取结扎线以下缺血/再灌注心肌1～3片（厚3～4 mm），并投入4%的甲醛溶液中固定。

　　1.8  组织学检查 

　　固定后的心肌组织经石蜡包埋、切片，脱蜡水化，苏木精-伊红染色，光镜下观察病理变化。Bax、Bcl-2的检测：从4%的甲醛溶液中取出固定好的组织块，石蜡包埋，切片，脱蜡入水。3% H2O2猝灭内源性过氧化物酶，微波加热抗原修复，滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封闭液，一抗（1∶100稀释）4℃过夜，生物素标记二抗室温30 min，DAB显色。阴性对照以PBS代替一抗。结果判断：胞质出现棕黄色颗粒者为阳性。在400倍高倍镜下用Leica Quin Standard V2.8图像分析系统进行图像分析，每张切片随机选取10个视野计算灰度值的均数及标准差。

　　1.9  毛细血管密度的检测 

　　组织切片在普通光镜下放大400倍，每张切片随机选取10个高倍视野，计算每个视野内直径<10 μm的毛细血管数目，计算其平均值。

　　1.10  统计学处理 

　　所有数据均以±s表示。采用SPSS 13.0软件进行统计分析，2组间比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2  结  果

　　2.1  一般情况 

　　本实验共使用动物30只，其中2只死于气胸，3只死于麻醉意外，25只模型成功。其中17只出现不同程度的再灌注后的心律失常，主要表现为室性期前收缩、房室传导阻滞、短阵室性心动过速。

　　2.2  左心室功能检测结果 

　　再灌注后Sham组LVDP及±dp/dtmax均高于NS组及G-CSF组（P＜0.01），G-CSF组LVDP及±dp/dtmax均高于NS组（P＜0.01或＜0.05）。见表1。表1  再灌注后各组左心室功能指标的比较（略）

　　2.3  免疫组化检测结果
 
　　NS组和G-CSF组中Bax和Bcl-2的表达均显著高于Sham组(P＜0.01）；NS组Bax的表达明显高于G-CSF组（P＜0.01），Bcl-2的表达则明显低于G-CSF组（P＜0.01）。见表2。表2  各组心肌细胞Bax和Bcl-2的检测结果比较
（略）

　　2.4  毛细血管计数 

　　Sham组的毛细血管计数低于NS组及G-CSF组(P＜0.01）;NS组的毛细血管计数低于G-CSF组（P＜0.05）。见表3。表3  各组毛细血管计数的比较（略）

　　2.5  血白细胞计数 

　　在使用生理盐水和G-CSF预处理前各组白细胞计数差异无显著性（P＞0.05），预处理后G-CSF组白细胞计数显著高于NS组及Sham组（P＜0.01）。见表4。表4  各组血白细胞计数的比较（略）

　　3  讨  论

    Kajstura等［5］研究了在不同的缺血时间（从20 min到7天）凋亡和坏死对心肌梗死面积的影响，在冠脉结扎2 h的时候，以细胞凋亡为主，细胞凋亡在4.5 h的时候达到峰值水平，而在持续到1天的时候坏死水平达到峰值。由此可见心肌细胞的凋亡在缺血早期占有重要地位。

    一些研究认为Bcl-2（Bcl-XL）/Bax（Bak）的比值决定了细胞的生存或死亡［6］，抗凋亡蛋白Bcl-2能够明显的改善心肌的缺血/再灌注损伤，只在心脏过表达Bcl-2的转基因鼠在再灌注模型中显示能减少46%～64%的心肌梗死面积［7］。本研究结果显示，G-CSF预处理上调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，抑制了促凋亡蛋白Bax的表达，减少了心肌细胞在缺血/再灌注中的的凋亡，改善了左心室功能；而升高的白细胞并没有影响G-CSF预处理对心肌细胞的保护作用。

    Orlic等［8］采用SCF-1及G-CSF预处理心肌梗死大鼠，发现G-CSF能够降低心肌梗死大鼠的死亡率，改善其心肌功能，以及能够促使源于骨髓的干细胞横向分化成心肌细胞。但这一观点引起争论，有学者认为骨髓的干细胞没有横向分化成心肌细胞，而是骨髓的干细胞和心肌细胞发生了细胞融合［9～11］。

    近年来的研究发现，在心脏的心肌细胞、血管内皮细胞都存在G-CSFR（G-CSF受体），并且在心肌梗死之后G-CSFR的表达上调，局部的G-CSF浓度也平行增加［12-13］，这提示内源性的G-CSF在心脏保护中发挥了调节作用。G-CSF能够上调G-CSFR的表达，激活下游的Jak/Stat路径，减少急性期心肌细胞的凋亡，上调胶原酶MMP 1，明胶酶MMP 9表达，促进心肌坏死组织的瘢痕修复，改善心室重塑［14-15］。近来Harada等［16］证明了G-CSF作用于心肌细胞内的G-CSF受体激活下游Jak/Stat路径上调了抗凋亡蛋白的表达，改善了小鼠心肌梗死急性期及亚急性期的预后，G-CSF在心肌梗死急性期的抗凋亡作用改善了梗死后心肌的生存。而这种保护作用在Stat-3突变的大鼠中消失。在局灶性脑缺血的研究中也发现了G-CSF能够激活JAK2/STAT3路径，上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而抑制了暂时性的脑缺血引起的神经元的凋亡［17］。因此，使用G-CSF对动物进行预处理能够减轻心肌缺血/再灌注损伤，减少心肌细胞凋亡，可能是因为直接激活了心肌内的G-CSFR以及相关的细胞内信号转导途径，上调了Bcl-2/Bax的比值。

    在体外实验以及动物实验中G-CSF能够通过激活血管内皮细胞的受体促进血管内皮细胞的迁移和增殖［18］，增加心肌梗死边缘的毛细血管的密度，改善微循环，促进侧支循环的生成。在本实验中也观察到了这一现象。

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