Rb在婴幼儿皮肤血管瘤不同时期的表达及意义

作者：于浩，刘树发

作者单位：佳木斯大学附属口腔医院颌面外科，黑龙江 佳木斯 154003

【摘要】  目的：探讨Rb蛋白在血管瘤发生、发展及退化过程中的表达状况及其意义。方法：采用免疫组织化学方法（SABC法）检测人皮肤血管瘤增生期、退化期及正常皮肤组织中Rb的表达水平，并结合第Ⅷ因子相关抗原的免疫组织化学染色证实表达Rb的细胞是血管内皮细胞。利用计算机图像分析技术测量不同时期血管瘤组织和正常皮肤组织Rb表达的积分光密度和面积。结果：增生期血管瘤内皮细胞Rb表达水平低于退化期，差异有显著性（P<0.05），退化期血管瘤内皮细胞Rb表达水平与正常皮肤组织相比，差异有显著性（P<0.05）。结论：Rb通过抑制血管瘤内皮细胞增殖和血管生成而在血管瘤的退化过程中起重要作用。

【关键词】  血管瘤；Rb；内皮细胞；血管生成

　　ex[x]pression of Rb in infantile cutaneous hemangioma

　　YU Hao,LIU Shufa

　　Maxillofacial Surgery of Stomatological Hospital,Jiamusi University,Jiamusi 154003,China

    Abstract：ob[x]jective:To investigate the ex[x]pression and significance of Rb in the occurrence, development and regression of infantile hemangiomas.Methods:The ex[x]pression of Rb was examined in the proliferative stage and catagen  of human hemangiomas and normal skin tissues by using immunohistochemical technique.Immunohistochemical technique for factorⅧ-related antigen was used to prove that the cells which expressed Rb were endothelium.Image analysis system was applied to measure the ex[x]pression level of Rb at different stages of hemangiomas and in normal skin tissues.Results:The ex[x]pression of Rb was significantly lower in proliferating hemangiomas than that in involuting hemangomas(P<0.05).Conclusion:Rb might play an important role in the regression of human hemangioma endothelial cells and anti-angiogenesis.

    Key words：hemangioma; Rb; endothelial cell; angiogenesis

　　血管瘤是婴幼儿常见的良性肿瘤，出生时不存在，出生后1个月内出现。其患病率为3%～8%,血管瘤发生的相关因素有：①种族②性别③家族史④出生体重⑤产前检查等［1,2］。持续发展的血管瘤可产生溃疡、出血、感染、器官功能损害（视觉及听觉、呼吸和循环系统、骨骼损害及肢体畸形）等一系列并发症，而位于颜面、颅内及口腔的血管瘤可引起明显的畸形及功能障碍，严重影响患者的身心健康［3］。血管瘤是一种以血管内皮细胞异常增殖、大量血管增生为主要病理学特征的良性血管病变，至今对其病因及发病机制仍不十分清楚［4］。细胞周期与肿瘤的关系是近年来生命科学研究中的热门课题之一。细胞周期是细胞生命活动的基本过程，正常情况下，细胞在周期时相的变迁中进入增殖、分化、衰老和死亡等生理状态。如果细胞周期调控异常，细胞将进入病理状态，如细胞转化、癌变。Rb是细胞周期调控系统中的重要因子，是一种抑癌基因，阻断细胞周期从G1到S期的转换，从而抑制细胞增殖，由于目前鲜有关于Rb与人皮肤血管瘤相互关系的文献，为此我们应用免疫组织化学方法检测不同时期人皮肤血管瘤组织中以及正常皮肤组织中Rb蛋白的表达，并结合第Ⅷ因子相关抗原的免疫组织化学染色证实表达Rb的细胞是血管内皮细胞，以探讨Rb在血管瘤发生、发展过程中的作用机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  材料来源　

    收集佳木斯大学附属口腔医院病理科2001～2007年皮肤血管瘤存档蜡块49例，其中男28例，女21例，小年龄40d，大年龄5岁。这些血管瘤所在的部位有头皮、前额、眼睑、耳背、颈部、背部、上臂、大腿、手和足的皮肤等。所有的患者术前均未接受任何可能引起Rb抗原改变的放射治疗、化学治疗及免疫治疗等。

    1.1.2  材料分组 

    蜡块切片厚5μm，常规HE染色和免疫组织化学SABC法检测增殖细胞核抗原（PCNA, proliferating cell nuclear antigen），按Mulliken［5］分类标准并结合PCNA的表达进行分组。增生期血管瘤26例，退化期血管瘤23例，另取瘤组织周围正常皮肤组织5例作对照。

    1.2  主要试剂和仪器

    浓缩型兔抗人Rb单克隆抗体，即用型兔抗人PCNA单克隆抗体，即用型兔抗人第Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体，即用型SABC通用型免疫组织化学试剂盒，DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸。以上试剂均购于福州迈新生物技术开发公司。

    1.3  方法

    常规HE染色:免疫组织化学SABC法检测Rb、PCNA和第Ⅷ因子相关抗原。主要步骤：5μm组织切片常规脱蜡至水，Rb和PCNA采用高压抗原修复，第Ⅷ因子相关抗原采用胃酶消化修复抗原，3%过氧化氢处理10min以抑制内源性过氧化物酶活性，正常羊血清处理15min以减少非特异性背景，一抗4℃孵育过夜，生物素标记的二抗处理15min，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物处理15min,DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。

    1.4  免疫组织化学结果判断
 
    采集免疫组织化学染色图像，用Image-Pro Plus分析软件进行图像分析，每张切片取5个视野测定Rb、PCNA阳性产物的积分光密度值（IOD值）和面积（AREA），取平均值代表阳性产物表达强度，IOD /AREA值越大表示阳性产物表达越强。

    1.5  统计学方法

    实验所得数据用表示，用SPSS11.0软件对各组数据进行方差齐性检验，各组数据间的差异进行单因素方差分析。

       2  结果

    2.1  HE染色　

    退化期血管瘤组织中可见内皮细胞减少，血管腔增大，血管间结缔组织增多，内皮细胞核扁平，见图1；增生期血管瘤组织中可见条索状或团块状内皮细胞增生，其间有不规则的内皮间隙和完整的血管腔，内皮细胞核肥大而淡染，见图2。
   
　　2.2  PCNA的表达 

    增生期血管瘤内皮细胞核肥大，核内弥漫分布棕黄色颗粒，PCNA强表达；退化期血管瘤内皮细胞核扁平，大多数细胞核被苏木精染成蓝色，少数胞核内有少量棕黄色颗粒，PCNA弱表达，见图3～4。
   
　　2.3  第Ⅷ因子相关抗原的表达　

    增生期和退化期血管瘤内皮细胞胞浆内弥漫分布棕黄色颗粒。

    2.4  Rb的表达　

    Rb抗原阳性物质主要定位于血管内皮细胞膜，部分胞浆着色。增生期血管瘤内皮细胞胞核或胞浆内有较少棕黄色颗粒沉积，Rb表达较弱，见图5；在退化期的血管瘤内皮细胞胞核或胞浆内有较多棕黄色颗粒沉积，Rb表达较强，见图6；正常皮肤组织血管内皮细胞胞核或胞浆内有极少量棕黄色颗粒沉积，Rb表达极弱，见图7。不同时期Rb表达积分光密度和阳性面积，见表1。表1  不同时期Rb表达的积分光密度和阳性面积(略)

　3  讨论

    1989年Rb基因被鉴定分离出来。Rb基因定位于人13号染色体的长臂1区4带（13q14）上，有27个外显子，26个内含子，Rb基因的27个外显子融合形成4757bp的mRNA，由928个氨基酸组成的分子量约为110000的Rb蛋白，主要存在于核内为核磷蛋白［6］。Rb基因发生突变或缺失导致细胞过度增殖，形成肿瘤，并已证实Rb为肿瘤抑制基因。在Rb患者中, Rb基因发生杂合缺失或点突变，导致Rb失活。有报道发现Rb病人Rb基因启动子CpG岛发生过度甲基化，从而导致Rb基因的失活。真核细胞分裂增殖必须通过两个关键的细胞周期调控点（checkpoint）：G1/S和G2/M关卡调控点，目前对G1/S调控点途径研究得较为深入，Rb蛋白是该调控点的中心，它调控的上游组分包括一系列Cyclin-CDK复合物、CDK活化激酶（CDK activating kinase，CAK）和CKI。这些调节成分组成多条调节途径，以Rb蛋白为中心，Cyclin与相应的CDK结合为激酶复合物对Rb进行磷酸化，磷酸化的Rb释放与其结合并抑制的蛋白，主要是转录因子E2F家族以及具激酶活性的CAb蛋白等，促进这些基因的表达，这些基因产物促进细胞通过G1/S调控点，使细胞周期贯序进行。CKI通过抑制Cyclin-CDK激酶活性，使Rb保持去磷酸化状态，去磷酸化的Rb与E2F形成复合物，阻断了E2F的转录活性，使细胞周期不能贯序进行，从而抑制细胞增殖。在这一调控途径中p16 -CyclinD1-CDK4/6-Rb-E2F途径是比较明确的［3］。

    本实验结果显示：Rb抗原在小儿血管瘤增生期少量表达，在消退期表达的很多，处于较高水平，消退期Rb表达水平明显高于增生期，二者差异有显著性（P＜0.05）。因此我们推断：因为游离的E2F进入核内结合一系列具特殊序列的基因启动子区（如C-myc、B-myb、cdc2、二氢叶酸还原酶、TK及E2F1基因的启动子区），促进这些基因的表达，这些基因产物促进细胞通过G1/S调控点，使细胞周期贯序进行。CKI通过抑制Cyclin-CDK激酶活性，使Rb保持去磷酸化状态，所以去磷酸化的Rb与E2F形成复合物，阻断了E2F的转录活性，使细胞周期不能贯序进行，从而抑制血管内皮细胞增殖，抑制血管瘤的生长。

    血管瘤是一种良性肿瘤,内皮细胞过度增殖和血管迅速生长是血管瘤病理组织学的大特点。近年来研究表明［7，8］，血管内皮细胞和血管形成在血管瘤病理演变过程中起重要作用。血管瘤作为一种血管生成性疾病，内皮细胞增殖和血管生成并非单一因素作用的结果，每一个环节都有可能有多基因和多因素共同参与。通过以上研究，我们推测P27在抑制血管瘤内皮细胞增殖和血管形成中发挥一定作用，有利于进一步探讨血管瘤的病理演变机制。

【参考文献】
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　　［4］林晓曦，祁左良，董佳生，等.葡萄酒色斑增生机制的研究［Ｊ］.实用美容整形外科杂志，2000,11(3):126129

　　［5］Mulliken JB,Glowacki J.Hemangiomas and vascular malforma-tions in infants and children:a classification ba[x]sed on endothelial characteristics［Ｊ］.Plast Reconstr Surg,1982,69(3):412422

　　［6］Batchelor AH,Piper DE,Mcknight SL,et al.The structure of GABP alpha/beta:an ETS domain-ankyrin repeat heteroclimer bound to DNA［Ｊ］.Science,1988，279(5353):1037１０41

　　［7］Pollman MJ,Naumovski L,Gibbons GH. Vascular cell apoptosis:cell type-specific modulation by transforming growth factor-beta1 in endothelial cell versus smooth muscle cell［Ｊ］.Circulation,1999,99(15):2019

　　［8］Jang YC,Isik FF,Gibran NS.Nerve distribution in heman-giomas depends on the proliferative state of the microvascula-ture［Ｊ］.J Surg Res,2000,93(1):144