原子力显微镜观察Jagged1对DC分化的影响 作者：王炯坤, 胡明铅, 邢飞跃

 作者：王炯坤, 胡明铅, 邢飞跃

【摘要】 目的: 探讨Jagged1对树突状细胞(DC)分化的形态学影响。方法: 应用骨髓法诱导培养DC, 并利用原子力显微镜(AFM)观察细胞的超微结构。结果: 与对照组相似, Jagged1组的细胞形态不规则, 伪足分化和突出的片状结构较为明显, 且表面粗糙; 相反, DAPT组细胞的伪足不明显, 多数细胞趋于圆形, 表面相对光滑。此外, Jagged1组的细胞高于对照组和DAPT组, 而直径则与对照组相当。结论: Jagged1对DC分化形态的影响不大, 而DAPT组的细胞形态发生明显改变。

【关键词】 Jagged1; 树突状细胞; 原子力显微镜; 超微结构

［Abstract］ AIM: To explore the effect of Jagged1 on the morphology of dendritic cell(DC) differentiation. METHODS: Mouse bone marrow cells were cultured in the presence of rmIL4 and rmGMCSF. Atomic force microscopy (AFM) was used to observe the ultrastructure of these DC. RESULTS: Similar to the control, the cells in Jagged1 group displayed irregular shape with spiny or sheetlike dendrites and the cellular surface was rough. In contrast, the cells in DAPT group exhibited little dendritic processes and most of them were of round shape and with smooth surface. Furthermore, the height of the cells in Jagged1 group was higher than that in control and DAPT group, while the diameter of the cells in both was roughly equivalent. CONCLUSION: Jagged1 has no significant effect on the morphology of DC, but significant changes in the morphology of DC in DAPT group have occurred.

［Keywords］Jagged1; dendritic cell; atomic force microscopy; ultrastructure

［摘 要］ 目的: 探讨Jagged1对树突状细胞(DC)分化的形态学影响。方法: 应用骨髓法诱导培养DC, 并利用原子力显微镜(AFM)观察细胞的超微结构。结果: 与对照组相似, Jagged1组的细胞形态不规则, 伪足分化和突出的片状结构较为明显, 且表面粗糙; 相反, DAPT组细胞的伪足不明显, 多数细胞趋于圆形, 表面相对光滑。此外, Jagged1组的细胞高于对照组和DAPT组, 而直径则与对照组相当。结论: Jagged1对DC分化形态的影响不大, 而DAPT组的细胞形态发生明显改变。

［关键词］Jagged1; 树突状细胞; 原子力显微镜; 超微结构

Notch是在果蝇中发现的调控胚胎发育的I型跨膜蛋白, 在细胞的增殖、 分化和凋亡的进程中起着重要的作用［1］。Jagged1作为Notch蛋白的主要配体之一, 丰富地表达于骨髓基质细胞, 影响树突状细胞(dendritic cell, DC)细胞的发育和分化。Gabrilovich小组的研究表明Notch信号通路是DC分化所必需的, Jagged1阻止DC分化成熟, 而Deltal促进DC分化成熟, 敲除Notch1的胚胎干细胞和造血前体细胞不能分化成DC或不表达成熟的表面标志物［2］。相反, MacDonald小组运用条件敲除骨髓Notch1基因的小鼠则表明Notch1不影响DC的发育［3］。 另外, 也有研究表明, Jagged1能诱导人的单核细胞分化成成熟的DC。因此, Notch信号通路对DC分化的影响还存在争议。

原子力显微镜(atomic force microscopy, AFM)具有可直接在大气或液相中直接观察样品, 对样品无损伤, 且达到纳米精度的分辨率, 可测量细胞的高度、 长度和粗糙度等优点, 能更真实和细微地反映细胞的形貌特征的变化。因此, 本实验中利用AFM结合IL4和GMCSF体外诱导DC的经典模型观察Jagged1对DC分化的影响, 不仅为Notch信号通路在DC分化中的作用提供了形态学方面的证据, 也为AFM在细胞分化方面的运用进行了探索。

1 材料和方法

1.1 材料 雄性SPF级BALB/c小鼠(6周龄, 体质量18～22 g), 购自中山医科大学实验动物中心。RPMI1640培养液、 胎牛血清(FBS)为GibcoBRL公司产品。L谷氨酰胺、 β巯基乙醇和DAPT(N［N(3, 5difluorophenyl)Lalanyl］Sphenylglycine tbutyl ester)均购自Sigma公司。rmIL4、 rmGMCSF购自Peprotech公司。Jagged1/Fc为R&D Systems公司。AntimouseCD11cFITC为eBioscience公司。戊二醛为日本京都公司。FACSCalibur流式细胞仪购自Becton Dickinson公司。AFM购自Thermomicroscopes公司。

1.2 方法

1.2.1 骨髓细胞的制备 参照Lutz 等［4］法进行, 并略加改良。取BALB/c小鼠断颈处死, 无菌分离完整的股骨及胫骨, 剪断骨头两端, 用PBS冲洗骨髓腔, 充分吹打骨髓细胞团, 收集骨髓细胞悬液离心（300 g, 5 min）。用PBS重悬后加入红细胞裂解液, 37℃ 避光作用8 min后PBS洗2次（300 g, 5 min）。细胞重悬于含100 mL/L胎牛血清RPMI1640完全培养液中, 调整细胞密度为1×109/L。

1.2.2 细胞培养 取上述制备的骨髓细胞, 按1×106细胞数/孔铺于置有盖玻片的24孔培养板中, 第0、 3、 6天每孔加入2.5 μg/L rmIL4和10 μg/L rmGMCSF。第6天取诱导的胞用antimouseCD11cFITC染色, 经用FACSCalibur流式细胞仪测得CD11c阳性率达89.5%, 同时将实验分为对照组、 500 μg/L Jagged1组和5 μmol/L DAPT组（即5 μmol/L DAPT加入2 h后, 再加500 μg/L Jagged1）。

1.2.3 样品制备 第7天取出3个处理组中的盖玻片, 用25 g/L戊二醛进行固定细胞15 min, 室温自然干燥后用三蒸水冲洗3遍。

1.2.4 AFM样品观察 将制备好的样品放置于AFM的扫描台上, 在空气中接触式扫描样品。实验采用100 μm扫描器, 氮化硅探针, 悬臂（Park Scientific Instruments, Microlever）针尖曲率半径10 nm, 力常数约为2.8 N/m, 扫描速率0.3～0.8 Hz。所有图像经仪器配置软件（Thermomicroscopes proscan image processing software version 2.1)平滑处理。

2 结果

2.1 多个细胞的AFM观察 分别对对照组、 Jagged1组和DAPT组进行多细胞多次扫描, 累计细胞数达30个以上, 并对这些细胞进行直径和高度的测量。对照组和Jagged1组的细胞形态不规则, 伪足和突出的片状结构较为明显且相邻细胞之间相互缠绕, 而DAPT组的细胞的伪足不明显, 多数细胞趋于圆形。经随机软件测量分析, 对照组和Jagged1处的细胞直径约15～25 μm, 平均高度分别约为3.016 μm和3.787 μm; 而DAPT组的细胞直径约14～19 μm, 平均高度约为3.520 μm（图 1）。

2.2 单个细胞的AFM观察 从图1各组的多细胞图选择具有代表性的图进行单细胞放大扫描。从单个细胞的形貌图清晰可见细胞分化形成的伪足和片状结构。对照组的细胞伪足长, 细胞比较扁平, 由细胞膜衍生形成的片状结构明显且比较粗糙; Jagged1组的细胞具有中等长度及大量较短的伪足, 细胞稍微粗糙, 两细胞之间延伸的细胞膜相互连接; DAPT组的细胞则无明显的伪足和片状结构, 细胞也相对光滑（图 2）。单细胞的高度曲线图可见, 对照组高约为3.5 μm, 直径约为18 μm; Jagged1组高约为4.0 μm, 直径约为17 μm; DAPT组高约为2.6 μm, 直径约为13 μm（图 3）。

2.3 细胞表面超微结构 从图2各组单细胞中选取细胞中部进行细胞表面超微结构扫描。对照组的细胞膜表面有许多粗糙的小颗粒; Jagged1组不但膜表面有粗糙小颗粒, 而且膜凹突不平, 有一些孔洞; DAPT组的细胞的膜表面则较为光滑（图 4）。

3 讨论

骨髓基质为造血前体细胞的生存和发育提供重要的微环境, 主要通过细胞因子和细胞与细胞之间的相互作用影响T细胞、 B细胞和DC的分化［5］。功能缺失和功能获得研究表明, Notch与其配体的相互作用对造血前体细胞向T细胞或B细胞的发育起着重要作用。然而, 已有的研究表明Notch信号通路似乎主要在DC发育的晚期起作用［6］。因为Jagged1是骨髓基质中主要表达的Notch配体之一, 所以本实验研究Jagged1对DC分化的影响。

AFM通过针尖和样品的原子作用力获得表面形貌结构图, 对样品无损伤, 且制样简单, 分辨率可达分子水平, 因而比电子显微技术, X射线衍射技术更客观真实清晰地反映细胞的形态和表面的微观结构。我们采用原子力成像技术对Jagged1与DC分化的关系进行研究。有报道称, Jagged1能影响DC成熟表面标志的表达［2］。然而, 我们发现Jagged1组的细胞明显存在DC的分化特征, 包括伪足分化和突出的片状结构, 并且表面粗糙, 细胞直径与对照组相当, 但平均高度超过对照组。因此, Jagged1对DC分化的形态影响不明显。这说明表型上有差异不一定形态上也有差异, 也可能由于可溶性的Jagged1与胞膜上的Jagged1不同, 或者实验小鼠不同等造成的结果差异。DAPT作为Notch信号通路的阻断剂, 能够特异地阻断γ分泌酶的作用, 从而阻止Notch的活化［7］。结果显示, DAPT组的细胞较圆, 细胞膜表面相对光滑, 直径缩短, 且伪足和片状结构均不明显, 说明DAPT能显著影响DC的分化成熟。这可能是由于DAPT同时抑制了外源性和内源性的Jagged1, 以及其他促进DC成熟的配体对Notch的活化, 具体的分子机制还有待进一步研究。

因此, 利用原子力成像技术能够直观地反映DC分化的整体形态和微观结构的改变, 同时表明Notch信号通路对DC的分化成熟具有一定的影响。

【参考文献】
［1］ 焦志军, 周光炎. Notch信号途径: T细胞功能调控的新通路［J］. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 21(6): 828-830.

［2］ Cheng P, Nefedova Y, Miele L, et al. Notch signaling is necessary but not sufficient for differentiation of dendritic cells［J］. Blood, 2003, 102(12): 3980-3988.

［3］ Radtke F, Ferrero I, Wilson A, et al. Notch1 deficiency dissociates the intrathymic development of dendritic cells and T cells［J］. J Exp Med, 2000, 191(7): 1085-1094.

［4］ Lutz MB, Kukutsch N, Ogilvie AL, et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow［J］. J Immunol Methods, 1999, 223(1): 77-92.

［5］ Cheng P, Gabrilovich D. Notch signaling in differentiation and function of dendritic cells［J］. Immunol Res, 2008, 4（1）: 1-14.

［6］ Cheng P, Nefedova Y, Corzo CA, et al. Regulation of dendriticcell differentiation by bone marrow stroma via different Notch ligands［J］. Blood, 2007, 109(2): 507-515.

［7］ Sastre M, Steiner H, Fuchs K, et al. Presenilindependent gammasecretase processing of betaamyloid precursor protein at a site corresponding to the S3 cleavage of Notch［J］. EMBO Rep, 2001, 2(9): 835-841.