组织芯片技术探讨ERK1和p16在胃肠间质瘤中的价值

摘要】  目的： 应用组织芯片技术探讨细胞外信号调节激酶1（ERK1）与p16在胃肠间质瘤中的表达情况及两种蛋白间的相关性。 方法： 采用免疫组化Maxvision法检测40例胃肠间质瘤和40例正常对照组中ERK1和p16的表达情况。 结果： ERK1在胃肠间质瘤组中的表达水平高于正常对照组，而p16表达情况相反（P＜0.032)；未发现ERK1与p16之间有明确相关关系。 结论： ERK1与p16可能参与了胃肠间质瘤的发生、发展过程；组织芯片技术可用于大规模高效检测临床样本，具快速、方便、经济、准确的特点。
【关键词】 组织芯片；  胃肠间质瘤； 细胞外信号调节激酶1； p16；

    ［Abstract］  ob[x]jective: To investigate the ex[x]pression and correlation between extracellular signalregulated kinase(ERK1) and p16 in gastrointestinal stromal tumor  by tissue chip. Methods： The ex[x]pressions of ERK1 and p16 were examined by  the maxvision method in 40 GISTs and 40 normal in contrast group. Results： The ex[x]pression of ERK1 was higher in  GISTs than in the contrast group, while the ex[x]pression of p16 was higher in the contrary. There was no obvious relation between ERK1 and p16.  Conclusion： ERK1 and p16 may play a role in the development of GIST; the tissue chip is convenience, economic and reliable in large amount of testing samples.
    ［Key words］  gastrointestinal stromal tumor;  ERK1;  p16;  tissue chip
    胃肠间质瘤（gastrointestinal stromal tumor, GIST）是源于消化道常见的间叶组织肿瘤，多数特异性表达CD117蛋白（ckit受体，干细胞生长因子受体）。目前研究认为GIST的发生与ckit基因突变有关，该基因突变后，引起细胞内信号转导改变而导致细胞存活、增殖与分化［1］。CD117突变后，可通过一系列大分子相互作用引起级联反应。目前研究多的是RTKRASMAPK途径。细胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）通路是MAPK中的通路之一。ERK通路是受外界刺激时决定细胞命运的关键性因素，它的活化是将信号从表面受体转导至核的关键步骤，其持续性活化终促进了细胞的不断增殖和转化［1］。 肿瘤的发生是一个多因素多步骤的过程，除原癌基因的激活外，肿瘤抑制基因的失活也起着重要的作用。p16基因又称多肿瘤抑制基因（multiple tumor suppressor I，MTSI），对正常细胞周期具有调控作用，主要通过与细胞周期素D（cyclin D）竞争性结合细胞周期素依赖性激酶4或6（CDK4/6），并抑制其功能，使Rb保持低磷酸化或非磷酸化的活性状态，阻止细胞从G1期进入S期，抑制细胞的无限增殖［3］。有学者研究发现GIST中存在9号染色体缺失，认为这可能和GIST的恶性转化有关［4］。本研究采用组织芯片技术分析ERK1和p16在胃肠间质瘤中的表达，进一步探讨其在该肿瘤中的可能发病机制及意义，为临床研究提供一定的理论资料。
    1  材料与方法
    1.1   材  料
    收集南昌大学附属医院病理科、江西省肿瘤医院病理科、江西省人民医院病理科2004年9月～2005年10月间手术切除标本，经两名以上有经验的病理专家结合临床、大体、镜下和免疫组化结果诊断为胃肠间质瘤病例40例。根据WHO2000消化系统肿瘤分类及文献［5］分为低度危险组11例、中度危险组11例、高度危险组18例；并以40例取自胃肠道肿瘤大体标本肿瘤远端肌层组织作为正常对照组。所有标本均经甲醛固定，常规石蜡包埋、切片。40例标本来源患者中男性19例，女性21例。
    1.2  主要试剂
    兔多克隆抗体ERK1，工作浓度1∶100，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；鼠抗人单克隆抗体p16/MIS1，即用型快速免疫组化Maxvision检测试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司。
    1.3  实验方法 
    胃肠间质瘤组织芯片的构建和制备:将收集的40例胃肠间质瘤和40例正常对照标本制成组织芯片。组织芯片的基本制作过程：①芯片的设计；②根据设计将受体蜡块进行打孔，孔径大小与供体组织钻取孔径大小一致；③对供体组织HE切片作形态学观察并在供体蜡块上准确标记所需要的靶点；④利用打孔仪钻取靶点组织，并转移至受体蜡块相应的孔位上，制成所需的阵列蜡块。
    将制成的组织芯片制成4 μm切片，常规脱蜡水化；3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶；高温蒸汽辅助柠檬酸缓冲液抗原修复（CD117抗体为EDTA缓冲液修复）约5 min；滴加一抗，室温下孵育60 min；PBS漂洗，滴加即用型MaxvisionTM试剂，室温下孵育15 min；DAB显色，苏木素染胞核，盐酸乙醇分化、脱水透明，中性树胶封片。
    1.4  结果判断
    ERK1以细胞结构呈明确的棕黄色尤其是核内出现棕黄色颗粒为细胞阳性染色。ERK1以阳性细胞数＜30％为阴性，阳性细胞数≥30％为阳性［6］。p16以细胞质和细胞核内出现棕黄色颗粒为细胞阳性，仅细胞质或细胞核着色，以及显色强度与背景无差别为阴性。p16于5个高倍镜视野（×40）中，各计数100个细胞，按切片中阳性细胞的比例划分，阳性细胞数＞10％为阳性［7］。
    1.5  统计学方法
    本资料属于计数资料，用SPSS11.5软件处理。首先采用χ2检验，比较在GIST组和对照组中ERK1,p16的表达水平有无差异；若有差异，则进一步用行×列表资料的χ2检验分析实验组内低、中、高度危险组中ERK1,p16表达有无差异；若有差异则用χ2分割法来两两比较这3组之间的差异。以双侧P＜0.05，单侧P＜0.032为有统计学意义。
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2  结  果
    2.1  胃肠间质瘤组与正常对照组中ERK1与p16的比较
    ERK1以核内出现棕黄色颗粒为阳性染色。p16以细胞质和细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性表达（图1）。40例GIST中有24例ERK1表达阳性，12例p16表达阳性，与对照组中两种蛋白表达的差异有统计学意义（P<0.032）(表1)，表明ERK1和p16参与了GIST的发生发展过程。表1  GIST组与对照组中ERK1与p16的表达情况
    2.2  不同级别胃肠间质瘤中ERK1与p16比较
    本次研究未发现ERK1和p16在不同级别GIST组中表达存在统计学差异（P>0.05）（表2，3）。表2  不同级别GIST中ERK1和p16的表达情况表3  低、中度组合并后ERK1和p16的表达情况
    2.3  胃肠间质瘤中ERK1,p16之间的相关性
    对40例GISTs中ERK1和p16之间的表达关系进行线性相关分析，r=0.274,P>0.05，未发现两者之间有明确的相关性。
    3  讨  论
    人们认为异常的细胞信号转导系统对促进恶性肿瘤的形成起到了至关重要的作用［8］。其中酪氨酸激酶系统也许是细胞调控当中关键的分子信号系统之一［9］。现已证实大部分GIST中存在ckit基因的突变。突变后的KIT受体持续性活化，其下游的RAS蛋白也被活化，活化的RAS激活一个重要的通路丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）通路。MAPK通路是真核细胞介导细胞外信号到细胞内反应的重要信号转导系统，调节着机体细胞的生长、分化、分裂、死亡以及细胞间的功能同步化等多种过程［10］。在真核细胞中已确定MAPK有4条信号通路，其中了解得为清楚的一条是ERK通路。ERK通路包括ERK1（p44MAPK）和ERK2（p42MAPK）通路，两者功能相似。ERK是受到外界刺激时决定细胞命运的关键性因素，它能促进增殖，决定细胞向终末期分化或发生凋亡。ERK的活化是将信号从表面受体转导至核的关键步骤，其持续性活化终促进了细胞的增殖和转化［1］。本实验观察到ERK1在GIST组中的表达水平高于对照组中的表达水平，且差异有统计学意义，表明ERK1参与了GIST的发生发展过程。我们未发现ERK1在不同级别GIST中的表达差异，这与某些文献报道较一致［11］。
    p16基因位于人9p21，又称多肿瘤抑制基因I（multiple tumor suppressor I, MTSI），其编码产物p16蛋白，是细胞周期的有效调控者，又是抑制肿瘤细胞生长的关键因子［12］。
    在人类多种肿瘤中发现p16基因异常，表现为缺失或突变。其表现特点以基因缺失为主，且多为纯合子丢失。不同肿瘤突变频率不同，同一肿瘤的不同分化程度其缺失和突变率也不同。关于p16基因在GIST形成中的作用，众多学者的研究认为p16基因参与了GIST的发生、发展。本实验研究观察到p16在GIST组中的表达水平高于对照组中的表达水平，且差异有统计学意义，表明p16参与了GIST的发生发展过程。我们未发现p16在不同级别GIST中的表达差异，这与某些文献报道较一致［11］。
    理论上，ERK通路活化可使胞内cyclin D合成增多。而p16则通过与cyclin D竞争，结合并抑制CDK4/6，使之不能解除Rb基因对转录因子的抑制，从而抑制细胞增殖，阻止细胞生长。在正常的细胞周期中，细胞的增殖与抑制是受到精密调控的。但是在致瘤因子的长期刺激下，ERK通路被持续性活化，细胞处于不断的分裂增殖状态。细胞内高水平表达的cyclin D及cyclin    DCDK4/6复合物也将刺激p16基因的表达，竞争性抑制CDK4/6的活性。然而，p16基因是肿瘤中目前所知常发生改变的基因，主要表现为缺失或突变或甲基化而失活。导致p16基因发生突变的原因未明，而ERK与p16之间的关系目前也无统一的观点。有的认为ERK信号通路活化可诱导p16等抑癌基因表达，有的发现ERK通路活化常伴有p16基因缺失，而有的则认为ERK通路活化与p16表达间无明确联系。本实验未观察到ERK1与p16之间有何明确的关系，这与某些文献报道不一致，可能与收集标本数有限有关。两者之间的关系有待进一步实验证实。
    本研究采用组织芯片技术研究GIST中ERK与p16的表达情况，并初步探讨其意义。组织芯片特点是体积小，信息含量大，一次性实验即可获大量结果，可做HE染色、特殊染色、免疫组织化学染色、DNA和RNA原位杂交、荧光原位杂交。组织芯片蜡块可做100～200张连续切片，这样用同一套组织芯片即可迅速地对上百种生物分子标记（如抗原、DNA和RNA）进行分析、检测，因而备受组织病理学家的重视。我们制作了80例GIST的组织芯片，其中GIST40例，正常消化道管壁肌组织40例。每张组织芯片上样品排列整齐，外形为圆形或类圆形，较少有皱折和掉片现象。仅用几张芯片即完成了全部实验，极大地节约了研究经费并降低了劳动量，在短的时间内获得了GIST中ERK1和p16 K表达的全部数据。因此，应用组织芯片大规模高效检测临床组织样本是可行的，具有快速、方便、经济、准确的特点。
【参考文献】
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