B细胞非霍奇金淋巴瘤Bcl-2与Bcl-10基因表达及临床意义

作者：胡欣,杨顺娥,李迅　　作者单位：新疆医科大学附属肿瘤医院内科， 新疆 乌鲁木齐

　　【摘要】目的：研究癌基因B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)以及B细胞淋巴瘤/白血病-10(B cell lymphoma/leukemia-10，Bcl-10)在B-NHL组织及外周血中mRNA的表达水平，评价Bcl-2和Bcl-10 mRNA的检测作为协助病理诊断B-NHL的价值。方法：采用反转录聚合酶链反应(reverse transc[x]ription-PCR， RT-PCR)法检测Bcl-2和Bcl-10 mRNA在40例B-NHL肿瘤和20例淋巴结反应性增生( reactive hyperplasia of lymph node， RH )组织及外周血中的表达水平。结果：反转录RT-PCR检测Bcl-2和Bcl-10 mRNA在B-NHL组织中阳性表达率分别为72.5%和55.0%，外周血中分别为65.0%和47.5%;在淋巴结反应性增生中阳性表达率分别为 45.0%和20.0%，外周血中分别为35.0% 和 10.0%，B-NHL组织及外周血中Bcl-2和Bcl-10 mRNA表达均高于RH (P<0.05);Bcl-2和Bcl-10在B-NHL组织及外周血中表达均呈正相关性(r分别为0.487、0.558，P<0.05)。结论： Bcl-2和Bcl-10 mRNA在B-NHL及RH中表达差异有统计学意义，并且与病理诊断一致性较好，联合检测两基因的表达可作为协助病理诊断的指标，尤其是对于淋巴结不易穿刺活检的病例更有意义。

　　【关键词】 非霍奇金淋巴瘤;Bcl-2基因;Bcl-10基因;mRNA;RT-PCR

　　[ABSTRACT] ob[x]jective： To study the ex[x]pression of Bcl-2 and Bcl-10 gene in B-NHL and discuss the prognostic value. Methods： ex[x]pression of Bcl-2 and Bcl-10 gene were determined by RT-PCR in the tissues and blood of 40 patients with B-NHL as well as 20 patients with reactive hyperplasia of lymphnode. Results： Positive ex[x]pression rate of Bcl-2 mRNA in the tissues and blood of B-NHL were 72.5% and 55.0%， and positive rate of Bcl-10 mRNA were 72.5% and 55.0%， 65.0% and 35.0%， respectively. Positive ex[x]pression rate of Bcl-2 mRNA in reactive hyperplasia of lymphnode were 45.0% and 20.0%， and positive rate of Bcl-10 mRNA were 47.5% and 10.0%， respectively. Positive ex[x]pression rate of Bcl-2 and Bcl-10 mRNA in B-NHL was higher than reactive hyperplasia of lymphnode (P<0.05). Conclusions： There is significant correlation between the ex[x]pression of Bcl-2 and Bcl-10 mRNA in B-NHL and RH. Combination determinationof Bcl-2 and Bcl-10 mRNA could be predictors for prognosis of B-NHL.

　　[KEY WORDS] NHL; Bcl-2; Bcl-10; mRNA; RT-PCR

　　目前对于相当一部分B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)的疑难病例及组织学标本取材不易的患者，虽然临床高度怀疑此类疾病，但常因缺乏诊断证据而导致诊断困难以致延误治疗。另外，淋巴瘤也常与良性增殖性疾病及淋巴结核等疾病相混淆。所以，联合检测B-NHL患者肿瘤组织和外周血对正确、快速地确诊具有重要的临床意义。本研究拟通过测定B-NHL与淋巴结反应性增生(RH)组织及外周血中Bcl-2与Bcl-10 mRNA的表达，从基因水平协助病理为B-NHL的诊断提供参考。

　　1　材料与方法

　　1.1　一般资料

　　收集新疆医科大学第三临床医学院2009年12月～2011年1月间经病理组织学确诊(按WHO标准[1])，临床资料记录完整的未经化疗或放疗的40例B-NHL和20例RH患者的新鲜组织标本及血液标本。40例B-NHL中，男性28例，女性12例;年龄大84岁，小6岁，中位年龄43.5岁;病理分型及侵袭程度：其中惰性NHL(低度恶性)10例，皆为滤泡性淋巴瘤(FL);侵袭性NHL(中度恶性)30例，包括套细胞淋巴瘤(MCL) 5例，弥漫大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)25例。RH 20例，其中男性14例，女性6例，中位年龄50岁。

　　1.2　方法

　　1.2.1　总RNA的提取

　　分别选取50 mg冻存的肿瘤组织进行匀浆及2 mL新鲜外周血提取血细胞，按Trizol试剂盒(Invitrogen公司)说明书提取总RNA。

　　1.2.2　引物设计与合成

　　引物均委托上海生物公司合成。借助引物设计软件Primer Premier 5.0设计，选择β-actin作为内参照。引物序列为：(1)Bcl-2：上游：5′-AAGATTGATGGGATCGTTGC-3′; 下游：5′-GCGGAACACTTGATTCTGGT-3′，产物大小：229bp。(2)Bcl-10：上游：5′-AGG TCTGGACACCCTTGTTG-3′;下游：5′-TCGTGCTGGATTCTCCTTCT-3′，产物大小：257 bp。(3)内参β-actin：上游：5′-AGGTCATCACCATTGGCAAT-3′，下游：5′-ACTCGTCATACTCCTGCTTG-3′，产物大小：357 bp。

　　1.2.3　RT-PCR检测

　　cDNA合成按反转录试剂盒(Promega公司)说明书进行，20 μL体系中含总MgCl2 4.0 μL，R NA 9μL,10×缓冲液2 μL， dNTPs 2.0 μL， Oligo(dT)1.0 μl，Inhibiter 0.5 μL，逆转录酶2.0 μL。PCR反应按照PCR试剂盒(上海生工公司)说明书进行，取20 μL cDNA加入80 μL RNase-Free H2O，取其中6 μL加入PCR Master 10 μL，上下游引物各0.6 μL，H2O 2.8 μL，构成20 μL的反应体系。再置于94 ℃孵育5 min;94 ℃ 30 s,57.6 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s，循环35次;72 ℃延伸7 min，直到4 ℃终止反应。

　　1.3　电泳鉴定PCR反应产物

　　将扩增产物加入2.0%琼脂糖凝胶电泳槽孔中电泳(含EB 1.0 μg/mL)，电压80～100 V，持续约35 min，在紫外灯下利用凝胶成像分析系统观察结果200～230 bp范围内出现一条清晰条带为Bcl-2阳性，在220～250 bp范围内出现一条清晰条带为Bcl-10阳性。

　　1.4　统计学处理

　　实验结果均用SPSS17.0软件包进行统计学分析，采用χ2检验和Pearson相关分析，检验水准α=0.05。

　　2　结果

　　2.1　Bcl-2

　　2.1.1　B-NHL与RH组织及外周血中Bcl-2 mRNA的表达及关系

　　B-NHL与RH组织中Bcl-2 mRNA的阳性表达分别为72.5%、45.0%，差异有统计学意义(χ2=4.342，P<0.05);外周血中Bcl-2 mRNA的阳性表达分别为65.0%、35.0%，差异有统计学意义(χ2=4.848， P<0.05)，见表1。表1　B-NHL和RH组织及外周血中的Bcl-2 mRNA表达阳性率比较

　　2.1.2　内参照及目的基因的电泳结果

　　β-actin在320～360 bp范围内出现的亮条带为表达阳性;Bcl-2 mRNA在200～230 bp范围内出现一条清晰条带为Bcl-2阳性，无条带，片状模糊，或条带不存在上述范围者均为阴性，见图1、2。M：Marker　L2-0，L6-0，L7-0，L8-0，L9-0，L10-0为2、6、7、8、9、10号组织标本β-actin表达;L2-1，L6-1，L7-1，L8-1，L9-1，L10-1为组织中Bcl-2 mRNA的表达图1　B-NHL组织标本PCR电泳结果M：Marker　B2-0，B6-0，B7-0，B9-0为2、6、7、9号外周血标本β-actin表达;B2-1，B6-1，B7-1，B9-1为外周血中Bcl-2 mRNA的表达图2　B-NHL外周血标本PCR电泳结果

　　2.1.3　诊断试验评价

　　检测B-NHL组织中Bcl-2 mRNA表达，对其进行诊断试验的评价，结果如下：敏感度Se=0.725，特异度Sp=0.550，总符合率π=0.667，误诊率α=0.450，漏诊率β=0.275，阳性预测值PV+=0.763，阴性预测值PV-=0.500，一致性检验结果Kappa=0.268，P=0.037。检测外周血中Bcl-2 mRNA表达，也进行诊断试验的评价， Se=0.650， Sp=0.650，π=0.650，α=0.350，β=0.350，PV+=0.788，PV-=0.481， Kappa=0.276，P=0.028。

　　2.2　Bcl-10

　　2.2.1　B-NHL与RH组织与外周血中Bcl-10 mRNA的表达及关系

　　B-NHL与RH组织中Bcl-10 mRNA的阳性表达分别为55.0%、20.0%，差异有统计学意义(χ2=8.777， P<0.05)。外周血中的阳性表达分别为47.5%、10.0%，差异有统计学意义(χ2=8.242， P<0.05)，见表2。表2　B-NHL和RH组织及外周血中的Bcl-10 mRNA表达阳性率比较

　　2.2.2　诊断试验评价

　　检测B-NHL组织中Bcl-10 mRNA表达，对其进行诊断试验的评价，结果如下：敏感度Se=0.550，特异度Sp =0.850，总符合率π=0.650，误诊率α=0.150，漏诊率β=0.450，阳性预测值PV+=0.880，阴性预测值PV-=0.486，一致性检验结果Kappa=0.337，P=0.003。而检测外周血中Bcl-10 mRNA表达，也进行诊断试验的评价， Se=0.475， Sp =0.900，π=0.617，α=0.100，β=0.525，PV+=0.905，PV-=0.462， Kappa=0.303，P=0.004。

　　2.3　Bcl-2和Bcl-10 mRNA在B-NHL组织中表达的相关性

　　40例NHL中，Bcl-2和Bcl-10 mRNA均阳性表达者占 37.5%(15/40)，均未表达者占10.0%(4/40)，统计学分析Bcl-2和Bcl-10 mRNA的阳性表达差异有统计学意义(P=0.019)，但两者无相关性(P>0.05)。

　　3　讨论

　　Bcl-2基因是Yunis等[2]人早从滤泡性B细胞淋巴瘤细胞染色体上发现的，染色体易位使位于3'端的Bcl-2基因与14号染色体上的免疫球蛋白重链基因并列形成头尾结构，这一异常融合基因导致Bcl-2蛋白过度表达，编码大小为26kDa的蛋白，定位于线粒体膜、核膜以及内质网上，能在各种不同的正常组织和细胞的激活过程中表达。Bcl-2基因及其表达蛋白的作用在于普遍保护细胞免受多种刺激诱导的凋亡，维持细胞存活[3]，因此称其为凋亡抑制基因。本研究显示B-NHL中Bcl-2 mRNA的阳性表达率(72.5%)显著高于RH(45.0%)(P<0.05)。目前国内外多数研究使用HE及免疫组化的方法检测肿瘤组织中的Bcl-2蛋白表达，阳性率较本实验略高，考虑使用不同的实验方法造成结果之间存在误差，张洁霞等[4]研究随机分为两组共80例肺癌患者外周血中Bcl-2基因表达，实验组阳性率为60.0%(24/40)，对照组阳性率为55.0%(22/40)，治疗前两组Bcl-2基因表达阳性率比较无统计学意义(P>0.05)。对于相当一部分疑难病例，淋巴瘤常与良性增殖性疾病及淋巴结核等疾病相混淆，利用免疫组化实验很难将B-NHL与RH及其他良性疾病区分，在实际工作中也出现过误诊的病例，而且对于肿大淋巴结所在位置较深，体积较小时，例如纵膈内淋巴结、后腹膜淋巴结， 不易行穿刺或活检取得组织学标本，对于这些患者虽然临床高度怀疑其为恶性肿瘤，但常因缺乏病理学证据而导致诊断困难以致延误治疗。因此我们希望找到与金标准——病理诊断一致性较好，比免疫组化检测更具有特异性的分子生物学指标，帮助临床医生进行区分难以确诊的恶性肿瘤与良性增殖性疾病及淋巴结核等疾病。经过对诊断试验的评价，结果显示检测组织及外周血中的Bcl-2基因的表达与病理诊断结果具有较好的一致性，均具有统计学意义(P分别为0.037、0.028)，并且根据检测来源，利用组织敏感度高(Se=0.725)，而外周血的特异度更高(Sp=0.650)，诊断一致性更好(Kappa=0.276)。实验证实40例B-NHL中，Bcl-2 mRNA在NHL组织及外周血中表达呈正相关关系(r=0.487，P=0.001)，即两者的表达同时升高或降低。

　　Bcl-10基因是由Willis等[5]确认的一个凋亡相关基因，它位于染色体lp22上，己有研究表明，Bcl-10在正常组织中为低水平表达，但是在淋巴结、脾脏、睾丸和发育中的中枢神经系统中表达水平较高[6,7]。Zhang等[8]研究发现，培养的细胞中，野生型Bcl-10的表达有促凋亡和抑制细胞的恶性转化的作用，不过目前Bcl-10对于细胞凋亡的调节机制还不十分清楚。Yiu等[9]阐明Bcl-10通过激活NF-κB通路达到抑制凋亡的作用。本研究发现B-NHL中Bcl-10 mRNA的阳性的表达率(55.0%)显著高于RH(20.0%)(P<0.05)。本实验继续检测治疗前两组外周血中的Bcl-10 mRNA的表达分别为47.5%(19/40)和10.0%(2/20)，且差异具有统计学意义(P=0.004)。目前尚未见同样研究外周血中Bcl-10基因表达的相关文献报道。经诊断试验评价，结果显示检测组织及外周血中的Bcl-10基因的表达与病理诊断结果具有较好的一致性(P分别为0.003、0.004)，而且利用外周血检测的特异性更高(Sp=0.900)，误诊率更低(α=0.100)，而检测组织中的表达与病理诊断的一致性更好(Kappa=0.337)。实验证实40例B-NHL中，Bcl-10 mRNA在NHL组织及外周血中呈正相关性(r=0.558，P=0.000)，即表示两者的表达同时升高降低。

　　从实验结果分析，Bcl-2与Bcl-10基因表达的水平可以作为协助病理进行鉴别诊断的分子生物学指标，对于难以通过免疫组织化学检测结果与其他良性疾病相鉴别的病例，可以检测组织标本中两基因的表达，进行协助诊断。考虑高表达的病例更倾向于B-NHL，对于那些难以取得组织标本的病例，可以利用该基因表达特异度更高，诊断一致性更好的外周血标本进行检测，从而协助诊断，尽快给予有效的个体化治疗。本研究中Bcl-2与Bcl-10 mRNA在B-NHL组织中的表达不具有相关性(P>0.05)，说明这两个基因在B-NHL的表达上可能是相互独立的，故提示通过加强联合检测Bcl-2和Bcl-10 mRNA的表达可能对协助病理及免疫组织化学法明确B-NHL诊断具有一定的参考价值。