通过异型双功能交联剂N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡基二硫 )-丙酸酯 ( SPDP) 交联的方法制备

作者：刘金华1，周　洁2，冷　静3 作者单位：1.广西医科大学基础医学院免疫学教研室;2.广西医科大学附属医院泌尿外科;　3.广西中医学院( 广西　南宁　530021)

　　【摘要】 目的：制备穿膜肽TAT-EGFP与白蛋白微球(BSA-NP)偶联物，并检测其对膀胱癌EJ细胞的穿膜活性。方法：穿膜肽TAT-EGFP与白蛋白微球偶联物。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、电镜、荧光显微镜及共聚焦显微镜检测其共价连接及活性。结果：SDS-PAGE电泳鉴定TAT-EGFP与白蛋白微球是通过共价键连接;电镜显示二联偶联物(TAT-EGFP-BSA-NP)的构象;荧光显微镜及电镜显示了二联偶联物的穿膜活性。结论：成功的制备穿膜肽TAT-EGFP与白蛋白微球偶联物-TAT-EGFP-BSA-NP，且偶联物对膀胱癌细胞有穿膜活性。

　　【关键词】 穿膜肽;血清白蛋白微球;蛋白偶联;N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡基二硫 )-丙酸酯

　　Abstract：ob[x]jective：To prepare nanospheres coupled with cell-penetrating peptides(Cpps) and evaluate its ability to cross the plasma membrane of bladder cancer cell (EJ cell).Methods：The nanosphere coupled with TAT-EGFP was prepared by methods of crossli[x]nking via hetero-bifunctional cross-li[x]nker SPDP.Nanospheres and its penetrating activity were tested by SDS-PAGE electrophoresis，scanning electron microscopy and laser scanning confocal microscope (LSCM).Results：SDS-PAGE electrophoresis revealed the nanospheres li[x]nked covalently with TAT-EGFP.The penetrating activity of TAT-EGFP is preserved under scanning electron microscopy and LSCM.Conclusion：The preparation of TAT-EGFP-BSA-NP was succeeded.It was binded by covalent bond and it could penetrate EJ cell.

　　Key words：Cpps;nanosphere;protein-protein conjugation;SPDP

　　自1988年Green等[1,2]首先发现并证实人免疫缺陷病毒(HIV-1)的反式激活蛋白TAT具有跨膜转移的功能后，陆续发现了一些具有细胞穿透功能的氨基酸序列，长度多数小于30个氨基酸，被命名为穿膜肽(cell-penetrating peptides CPPs)或蛋白转导域( Protein transduction domains PTDs)，它们可以携带多种物质，包括亲水性蛋白、多肽、D N A甚至颗粒性物质等进行细胞内的传输，并且不受细胞类型的限制，关于穿膜肽的研究逐步成为热点。微球是近年来发展的新型给药体系，它既能保护药物免遭破坏，又与某些细胞组织有特殊亲和性人血清白蛋白毫微球是人体理想的药物载体，是目前用于制备带药毫微球的主要材料之一。关于穿膜肽与蛋白毫微球偶联物的制备及其活性鉴定的研究国内尚未见有报道。本实验利用分子量小、稳定表达，并在自身发光过程中对各种细胞均无明显毒害作用的增强型绿色荧光蛋白 ( enhanced green fluorescent protein，EGFP) 作为TAT的报告蛋白，采用异型双功能连接剂SPDP偶联穿膜肽与蛋白微球，并探讨二联偶联物的活性。

　　1　材料和方法

　　1.1　主要试剂和仪器

　　1.1.1　主要试剂

　　N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡基二硫 )-丙酸酯 ( SPDP) P3415-25mg为美国Sigma公司产品;二硫苏糖醇(DTT)slbCB233155-1g为德国Merck公司产品;超滤离心管Amicon Ultral UFC901008 15ml,10K 为美国Millipore 公司产品;亲和层析柱Ni-NTA Superflow Cartvidgekj30760 1]融合蛋白TAT-EGFP的大量表达、纯化：应用本课题组成功构建的含重组表达质粒Pet30a-TAT-EGFP的重组菌株BL21大量表达，用IPTG诱导，用pH=8.0的Tris裂解液以及超声波处理器裂菌，4℃、8000r/min,20min离心后留上清通过亲和层析柱Ni-NTA Superflow Cartvidge纯化，用同方法制备绿色荧光蛋白EGFP以作对照。用SDS-PAGE鉴定其纯度及分子量大小，制成干粉-20℃保存备用。

　　1.2.2　融合蛋白TAT-EGFP与白蛋白微球BSA-NP的偶联 样品处理原则及公式参照[3,4]，具体步骤如下：

　　步骤1：制备TAT-EGFP，BSA-NP的SPDP衍生物TAT-EGFP-PDP，BSA-NP-PDP 取适量的TAT-EGFP，BSA-NP溶于2ml 的0.01 mol/L磷酸缓冲液(PBS pH=7.5)中，按n(TAT-EGFP) /n(SPDP)=1/10，n(BSA-NP) / n(SPDP)=1/30的投料摩尔比值，计算所需要的SPDP量，先将其溶于无水乙醇中，然后于25 ℃缓慢将溶于乙醇的SPDP分别搅拌加入含有TAT-EGFP和BSA-NP的磷酸缓冲液中，继续缓慢搅拌30min后，10000r/min 30s，之后分别处理TAT-EGFP，BSA-NP的SPDP衍生物：将TAT-EGFP与SPDP的反应物离心后取上清放入超滤离心管，加入0.02 mol/L磷酸缓冲液(含0.15 mol/LNacl pH=7.5),3500g,4℃，离心15min，重复三次，以去除剩余的SPDP，即得TAT-EGFP-PDP，浓缩至2ml;将BSA-NP与SPDP的反应物离心后取沉淀，用0.01 mol/L的醋酸盐缓冲液( pH=4.5)1500 r/min 45s离心洗涤重复3次，去除剩余的SPDP，即得BSA-NP-PDP。留TAT-EGFP-PDP，BSA-NP-PDP100μl 用DTT法测定蛋白与SPDP摩尔比，并同时留样做SDS-PAGE电泳。

　　步骤2：BSA-NP-PDP巯基衍生物的制备 将BSA-NP-PDP沉淀分散于上述醋酸盐缓冲液中，加入DTT，使反应体系中DTT的终浓度为50mmol/L,25 ℃缓慢搅拌30min后用0.02 mol/L磷酸缓冲液(含0.15 mol/LNacl pH=7.5)离心洗涤3次，以去除DTT并取代醋酸缓冲液，这一步骤得到BSA-NP-PDP巯基衍生物BSA-NP-SH。

　　步骤3：二联偶联物TAT-EGFP -BSA-NP的制备 将BSA-NP-SH用0.01 mol/LPBS悬浮，立即与TAT-EGFP-PDP混合，混合均匀后马上测OD343的值，4℃缓慢搅拌反应≥16h,12000 r/min 45s，取上清测定OD343的值，计算交联产品的摩尔比。取沉淀用PBS离心洗涤4次，取沉淀即为二联偶联物TAT-EGFP -BSA-NP，用PBS混匀，于4℃保存。

　　步骤4：n(样品) /n(SPDP) 偶联产品摩尔结合比的测定 n(样品) /n(SPDP)摩尔比采用DTT法。取100μl待测样品，加人890μl 0.01 mol/L磷酸缓冲液( pH=7.5)，在343nm处测OD值;加人10μl新鲜配制的DTT，反应15分钟后，再测343nm处的OD值。由[5]可知产生1mol吡啶-2-硫酮，需要1mol的SPDP，已知吡啶-2-硫酮1 mol/L浓度在343nm的OD值为8.08×103，从反应前后OD值的变化差，就可推算出吡啶-2-硫酮的浓度，进而得出参加反应的SPDP的浓度。可用如下公式计算并通过 [4] 。

　　1.2.3　二联偶联物TAT-EGFP -BSA-NP鉴定

　　(1)二联偶联产物纯度、成分的检验 偶联产物分别进行非还原型和还原型SDS-PAGE凝胶电泳，采用质量分数10%的分离胶、5%的浓缩胶，以检验偶联产物的共价键连接以及偶联结果和产物的纯度;将偶联产物制成悬液，送广西医科大学电镜室进行扫描电子显微镜的观察。

　　(2)二联偶联产物穿膜活性的鉴定 荧光显微镜观察：将生长期的膀胱癌细胞(EJ细胞)用0.25%的胰蛋白酶消化下来，加入6孔板，每孔1×105个，培养24小时后用冰PBS洗涤3次，分为三组：1组实验组，加适量的TAT-EGFP -BSA-NP二连偶联物，用培养基补足1ml;2组阴性对照组，加等量的EGFP-BSA-NP偶联物，用培养基补足1ml;3组空白对照组，只加1ml培养基。37℃，5%CO2共培养6个小时后，弃掉培养液，用PBS洗涤3次，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，1000 r/min离心5min，弃上清;加培养基再次离心1000 r/min离心5min弃上清，以去除胰酶影响;用PBS悬浮细胞，置于荧光显微镜下观察二联偶联物的穿膜活性。电子显微镜观察：将生长期的EJ细胞加二联偶联物共作用10h后，用PBS清洗3次，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，1000 r/min离心10min，形成细胞团块，浸泡于固定液戊二醛中，送广西医科大学电镜室进行透射电子显微镜的制片及观察。

　　2　结果

　　2.1　蛋白表达产物SDS-PAGE结果

　　图1　重组质粒pET30a-TAT-EGFP、pET30a-EGFP诱导表达、纯化后SDS-PAGE分析M.蛋白标准Marker1.含pET30a+质粒的BL21空白菌对照2.重组质粒pET30a-TAT-EGFP未诱导表达3.重组质粒pET30a-TAT-EGFPIPTG诱导表达4.重组质粒pET30a-TAT-EGFP诱导表达裂菌后的沉淀5.重组质粒pET30a-TAT-EGFP诱导表达裂菌后的上清6.重组质粒pET30a-TAT-EGFP的上清纯化后蛋白7.重组质粒pET30a -EGFP上清纯化后蛋白以转入pET30a的BL21菌株以及IPTG诱导前的重组子为对照，收集大量表达裂菌后的上清及上清纯化液，进行SDS-PAGE电泳，结果分析如上图1：纯化后的蛋白TAT-EGFP，EGFP分子量分别在31kd,28kd 左右，没有明显的杂带，与预期相符。

　　2.2　融合蛋白TAT-EGFP与白蛋白微球BSA-NP的偶联结果

　　2.2.1　SPDP衍生物、偶联产物的摩尔比值

　　本实验所得到SPDP的衍生物的摩尔结合比分别是n(TAT-EGFP) /n(SPDP)=1 /?，n(BSA-NP) /n(SPDP)=1 /14.5，n(TAT-EGFP) /n(BSA-NP)= 1 /5;

　　2.2.2　偶联产物的SDS-PAGE结果

　　偶联产物的非还原，还原SDS-PAGE结果如图所示：图2　偶联产物的SDS-PAGE图谱M标准蛋白Marker;2.偶联产物的非还原型SDS-PAGE;3.BSA-NP;4.TAT-EGFP;5.偶联产物的非还原型SDS-PAGE偶联产物的非还原型SDS-PAGE结果见图3中的2。因为微球BSA-NP不能穿过SDS-PAGE胶，所以微球偶联物也不能穿透SDS-PAGE胶。从图中可以看到，产物中未见TAT-EGFP，BSA-NP条带，说明产物偶联完全，较均一，说明TAT-EGFP联到了微球上，这与预期结果一致。偶联产物的还原型SDS-PAGE结果见图3中的5。同样因为微球BSA-NP不能穿过SDS-PAGE胶，图中可以看到只有TAT-EGFP的条带，这与预期结果一致。以上结果说明偶联是成功的。

　　2.2.3　电子扫描显微镜结果

　　二联偶联物电子扫描显微镜观察结果见图3，图中可见微球光滑，圆球状，分散性一般。图3　偶联物电子扫描显微镜观察

　　2.2.4　偶联产物穿膜活性结果

　　(1)荧光显微镜观察二联偶联物的穿膜活性 照上述方法分3组，共作用6小时，荧光显微镜观察结果如图4所示，可见二联偶联物还保留其穿膜活性，与预期结果一致。图4　荧光显微镜观察偶联产物的穿膜活性结果A.明场观察;B.荧光显微镜荧光观察行1.空白对照组(细胞对照);行2.阴性对照组(EGFP-BSA-NP);行3.实验组(TAT-EGFP-BSA-NP)

　　3　讨论

　　化疗是肿瘤治疗的主要方法之一，而如何提高化疗药物的疗效并降低其一直是化疗治疗的关键。增加药物的浓度可以提高药物的疗效但同时药物的也加强，增加了病人的负担。不过，自1988年发现TAT可以无毒方式穿透细胞生物膜以来，细胞穿膜肽CPPs就成为研究热点。研究发现CPPs可以通过化学结合或基因融合等方式携带蛋白质、DNA、化学药物、核苷酸、40nm磁珠和200nm脂质体等各种生物大分子[5,6]穿透细胞生物膜和血脑屏障并且没有细胞毒性，在细胞生物学、基因治疗学以及药学等领域具有很大的研究价值。微球是近年来发展的新型给药体系，它既能保护药物免遭破坏，又与某些细胞组织有特殊亲和性。毫微球是一类由天然或者合成高分子物质制成的粒径为10～1000nm的固体颗粒，可通过毛细血管，可以携带较多药物，并具有缓释性[7,8]。目前用于制备带药毫微球的材料很多。人血清白蛋白毫微球含有大量游离的羟基及氨基便于交联，且结构清楚、生物性能稳定，并为人体自身白蛋白，不会增加过敏反应，是人体理想的药物载体[8]。如果将穿膜肽与化疗药物毫微球连接一方面利用穿膜肽的穿膜作用可以减少其穿膜时间;另一方面利用毫微球的缓释作用增加药物的有效作用时间，这样既可以提高疗效，又能降低化疗药物的，这对临床治疗具有重要意义。

　　本实验中我们使用的交联剂是异型双功能偶联剂具有专一、反应温和并容易控制反应量的优点，被广泛用于蛋白质的交联偶联物的制备。实验中我们用SPDP将穿膜肽TAT-EGFP与白蛋白毫微球BSA-NP进行偶联成功制备了二联偶联物TAT-EGFP -BSA-NP，并证明该二联偶联物是有活性的。我们制备的毫微球为比一般化疗药物更有疗效的剧毒药物提供了理想载体，我们制备的穿膜肽-毫微球药物传送系统对肿瘤治疗开辟了新的思路。