辛伐他汀、氨氯地平对实验性兔动脉粥样硬化进程中NOS/NO系统的影响

　   作者：戴琳　于清霞　王辉　周少玲 作者单位：264001　山东省，烟台市烟台山医院心电科(戴琳);青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院ICU(于清霞、王辉、周少玲)

　　【摘要】 目的　探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)-一氧化氮(NO)系统在动脉粥样硬化进程中的变化、相互关系及辛伐他汀、氨氯地平对动脉粥样硬化进程中iNOS-NO的影响。方法　24只家兔予以高胆固醇饮食8周，8周后随机分为三组(n=8)，三组均停用高胆固醇饮食，改普通饮食8周;模型组不用干预，另外两组分别喂饲辛伐他汀及氨氯地平进行药物干预。另取8只家兔予以普通饮食16周作为对照组。结果　与对照组比较，模型组血脂水平明显升高，血清NO含量明显降低，iNOS表达明显升高(P均<0.01)。与模型组比较辛伐他汀组血浆TC、TG、LDL-C、ox-LDL-C下降明显(P<0.01)，HDL-C升高(P<0.01);血清NO含量明显升高(P<0.01)，iNOS表达明显减少(P<0.05)。而氨氯地平组血脂水平与模型组比较无统计学差异(P>0.05);血清NO含量亦无统计学差异(P>0.05)，但iNOS表达明显减少(P<0.05)。结论　动脉粥样硬化进程中，辛伐他汀、氨氯地平均可以通过下调血红素加氧酶/NO系统而延缓动脉粥样硬化进程。

　　【关键词】 动脉粥样硬化;　血红素氧化酶(脱环);　一氧化氧合酶;　一氧化氮;　氨氯地平;辛伐他汀

　　【Abstract】　ob[x]jective　To investigate the change rule of nitric oxide synthase(NOS) / nitric oxide(NO) and the influence of simvastatin and amlodipine on the system in atherosclerotic progress.Methods　The rabbits received 1% cholesterol diet (n=24) for eight weeks;after eight weeks were fed with normal diet for eight weeks;one group (n=8) were administrated with simvastatin;one group (n=8) were administrated with amlodipine.Results　Compared with the controt group，in model group the levels of serum lipids were increased obviously(P<0.01);however，the levels of serum nitric oxide and inducible nitric oxide synthase in aortic were decreased markedly (P<0.01).Compared with model group，in amlodipine group the levels serum lipids and serum nitric oxide were no significant effects (P>0.05)，the ex[x]pression of inducible nitric oxide synthase in aortic reduced greatly(P<0.01).Conclusions　In atherosclerotic progress，simvastatin and amlodipine may delete atherosclerotic progress by decreasing the nitric oxide synthase(NOS)/nitric oxide(NO) system.

　　【Key words】　Atherosclerosis;　Heme oxygenase (decyclizing);　Nitric oxide synthase;　Nitric Oxide;　Amlodipine;　Simvastatin

　　20世纪80年代内皮源性舒血管因子被证实为内皮细胞释放的一氧化氮(nitric oxide，NO)，随后NO参与血管生物学功能的作用逐渐被阐明。目前大量实验证实内源性NO在动脉粥样硬化进程中具有重要作用。体内NO是由一氧化氧合酶(nitricoxide synthase，NOS)以L-精氨酸为底物催化合成的[1]。他汀类和钙拮抗剂的抗动脉粥样硬化作用已有肯定的报道，但具体机制尚需进一步研究。NO作为新近发现的动脉粥样硬化进程中重要介质，能通过抑制血小板凝集和黏附因子的表达阻断单核细胞与内皮细胞的黏附，同时 NO的抗氧化作用能够抑制 LDL的氧化，从而抑制动脉粥状硬化的进展。而他汀类和钙拮抗剂对NOS/NO系统的影响，国内外报道较少。本文通过动物实验观察了食饵性家兔主动脉诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达及NO生成量的变化以及辛伐他汀、氨氯地平对NOS/NO系统的影响。

　　材料与方法

　　1. 动脉粥样硬化模型的复制及动物实验分组：24只新西兰雄性大白兔(购自山东省农科院)，饲以120～140 g普通饲料，添加1%胆固醇粉1 g?d-1?只-1(湖南华富制药有限公司)，于傍晚给药。24只大白兔以胆固醇膳食8周后，随机分为三组，每组8只。组：模型组用普通饲料喂养8周。第二组：辛伐他汀(由浙江新昌京新制药有限公司提供，药品批号：0104111)组，每次10 mg，每日一次。继续给予普通饲料120～140 g，喂养8周。第三组：氨氯地平(由陕西超群科技股份有限公司制药厂提供，药品批号：000518)组，每次5 mg，每日一次。继续给予普通饲料120～140 g，喂养8周。对照组(普通喂食对照组)：8只新西兰大白兔，给予普通饲料120～140 g喂养16周。

　　2. 血脂测量过程及方法：于实验开始、8周末、16周末，禁食12 h以上，经耳缘静脉抽血，然后采用沉淀漂浮酶联法检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。

　　3. 血清NO含量的测定：于实验开始、8周末、16周末，禁食12 h以上，经耳缘静脉抽血，然后应用硝酸还原酶法[2]测定血清NO的含量，测定的试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

　　4. 主动脉光镜标本制作：16周末，麻醉动物后迅速开胸，暴露心脏，采用冰生理盐水(4 ℃)充分灌洗心脏，分离整个主动脉，于主动脉弓下缘水平切取长约1～2 cm主动脉，剥除外膜结缔组织，部分组织置入10%中性缓冲甲醛液中固定，常规石蜡切片，HE染色。

　　5. 主动脉α-actin、 CD68及 iNOS的表达：采用免疫组织化学方法进行染色，兔抗人α-actin单克隆抗体 、兔抗人CD68单克隆抗体、兔抗人iNOS多克隆抗体试剂盒均由北京中山生物工程有限公司提供。并采用华中科技大学同济医学院清平公司软件MPI-500多媒体彩色病理图文分析系统进行iNOS表达定量分析。

　　6. 统计学处理：应用SPSS for Windows 10.0 统计软件整理、分析数据，数值变量以均数±标准差(x-±s)表示。两组间均数比较采用Student′s t检验。同组用药前后均数比较采用配对t检验。双变量间作直线相关分析用Pearson法。统计学显著性检验水准为0.05(双侧)。

　　结　　果

　　1. 血脂检测结果：对照组TC(1.28±0.43)mmol/L，TG(0.85±0.44)mmol/L，LDL-C(0.95±0.25)mmol/L，HDL-C(0.50±0.13)mmol/L，模型组TC(11.74±3.11)mmol/L，TG(1.28±0.36)mmol/L，LDL-C(9.34±2.88)mmol/L，HDL-C(0.44±0.21)mmol/L，与对照组比较TC、TG、LDL-C水平明显升高(P<0.01);HDL-C降低(P<0.01)。辛伐他汀组血浆TC[(4.41±3.88)mmol/L]、TG[(0.52±0.28)mmol/L]、LDL-C[(3.01±3.32)mmol/L]较模型组明显下降(P<0.01)，HDL-C[(0.63±0.12)mmol/L]较模型组升高(P<0.01);而氨氯地平组血浆TC[(9.66±4.56)mmol/L]、TG[(1.04±0.31)mmol/L]、LDL-C[(8.89±3.42)mmol/L]与模型组比较呈降低趋势，但无统计学差异(P<0.01)。

　　2. 血清NO测定结果：与对照组相比较，模型组血清NO含量明显降低(P<0.01)，辛伐他汀组血清NO含量较模型组明显升高(P<0.01)。而氨氯地平组血清NO含量与模型组比较无统计学差异(P>0.05)(表1)。表1　各组兔在不同阶段血清NO含量的测定结果

　　3. 大体病理学观察：16周正常对照组兔主动脉内膜光滑，无脂质沉积。动脉粥样硬化模型组，可见动脉内膜面有浅黄色斑块状突起，散在或融合成片，多分布于血管分叉周围，其长轴多与主动脉长轴平行，以主动脉弓部病变重。16周末药物治疗组斑块突起较动脉粥样硬化组减少，以辛伐他汀组为显著。

　　4. 免疫组织化学检测结果：iNOS的阳性染色主要位于中膜的平滑肌细胞胞浆内及内膜的巨噬细胞胞浆内，呈棕黄色颗粒。在正常对照组主动脉内膜及中膜呈阴性反应，模型组主动脉内膜及中膜均可见呈条状及点片状的阳性染色区。药物干预组兔主动脉内膜及中膜iNOS染色呈弱阳性(图1)。

　　5. 主动脉iNOS表达的定量检测：采用图像分析仪定量检测，主动脉iNOS表达值对照组为7.17±0.14，模型组为13.26±2.01，辛伐他汀组为11.09±0.25，氨氯地平组为10.15±0.33。模型组iNOS表达明显高于对照组(P<0.01)，药物干预组iNOS表达低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

　　讨　　论

　　大量实验已证实NO在心血管系统中具有重要作用，在生理状态下NO在血管扩张中起重要作用，但在血管内皮损伤时，内皮型NOS表达活性下降，内源性NO减少，而平滑肌细胞表达的iNOS活性增加，产生大量NO自由基，刺激细胞凋亡和胶原组织降解，促进动脉粥样硬化形成，NO自由基还可与过氧阴离子反应形成氧化亚硝酸盐，引起组织损伤。

　　高脂血症是动脉粥样硬化的发病机制之一，其他的危险因素还包括高血压、 糖尿病和吸烟等。内皮细胞损伤是各种危险因素作用引起动脉粥样硬化过程中的共同起始病变，机械性刺激、 氧化 LDL和糖化蛋白等因素能直接刺激并活化内皮细胞，继而引发白细胞和炎细胞的黏附，进而游走、 侵入内皮细胞下。本实验通过高胆固醇饮食8周，来诱发动脉粥样硬化模型成功，充分证明了高脂血症为动脉粥样硬化的高危因素，经药物干预后，辛伐他汀组血脂水平明显下降，氨氯地平组血脂下降不明显;血清NO水平两组均呈上升趋势，以辛伐他汀组为著(P<0.05);主动脉iNOS的表达模型组明显高于其他各组，经药物干预后两组表达均下降(P<0.05)，大体病理示动脉粥样硬化斑块较前明显消退。上述结果表明辛伐他汀及氨氯地平均有抗动脉粥样硬化作用，但两种药物抗动脉粥样硬化机制有所不同，辛伐他汀可通过降低血脂水平来改善内皮功能，从而抑制动脉粥样硬化进程，但另外近年来动脉粥样硬化发病机制中的炎症免疫学说备受人们关注，本实验模型组血清NO(内皮源性)明显下降，即内皮功能低下，但主动脉组织中iNOS表达明显增加，而iNOS主要由炎性细胞因子诱导产生，从而进一步证实了动脉粥样硬化进程中的炎症学说，经辛伐他汀干预后iNOS表达明显下降，亦进一步证实了他汀类药物抗动脉粥样硬化作用的多效性[3-5]。氨氯地平能减轻动脉粥样硬化斑块的程度，但对 TC、TG、LDL均无明显的抑制作用，也无升高HDL作用，因此其抗动脉硬化的作用并非通过调脂而实现，本实验我们发现模型组血清NO明显下降，但应用氨氯地平治疗后血清NO水平无明显改变，提示氨氯地平不是通过提高NO水平来改善内皮功能，氨氯地平可能是通过抗氧化、减少炎性因子及细胞因子的生成，来下调iNOS在主动脉中的表达，从而减缓动脉粥样硬化的进程[6-8]。