巨细胞病毒感染的细胞微丝骨架重组异常

　　作者：赵广圣,林茂芳　　作者单位：浙江大学医学院附属医院血液科，骨髓移植中心，杭州 310003;基金项目：浙江省科技厅重大项目基金资助项目，编号 001103058

　　【摘要】本研究探讨巨细胞病毒(CMV)感染对人胚成纤维细胞(HF)微丝骨架影响及与病毒复制状态的可能关系。用显微镜观察细胞形态，采用RT-PCR检测β-actin 表达，Western-blot检测胞内肌动蛋白质含量，间接免疫荧光标记病毒即刻早期抗原(IE)与微丝骨架探针观察HF细胞内感染状况及微丝骨架变化。结果表明： CMV感染率大于95%，IE抗原主要位于胞核。受染细胞变粗、变圆，甚至脱壁，呈时间依赖性。感染后72、96小时，受染细胞内β-actin表达呈渐进性下调，差异显著(P<0.05);96小时后胞内β-actin含量则为未感染组的(74.2±13.4)%，差异显著(P<0.05)。受染细胞内微丝排列紊乱，极性消失;细胞融合，荧光强度明显减弱。结论： CMV引起细胞内肌动蛋白质、微丝骨架形态及重组异常可能有助于其侵袭宿主细胞并进一步活化及复制。
　　【关键词】 巨细胞病毒;人胚成纤维细胞;β肌动蛋白;微丝

　　Impaired Microfilament Cytoskeletal Rearrangement in Cytome-galovirus Infected Cells　ZHAO Guang-Sheng，LIN Mao-Fang　Department of Hematology，Bone Marrow Transplantation Center，The First Affiliated Hospital，Medical College，Zhejiang University，Hangzhou 310003，China

　　Abstract The ob[x]jective of this study was to investigate the effect of cytomegalovirus (CMV) infection on actin and microfilament in human embryo fibroblast cells(HF) and to explore the possible relationship with CMV replication. The cell shape was observed by microscopy after the infection of CMV，RT-PCR assay was used to detect the mRNA ex[x]pression of β-actin gene，while Westen-blot was used to measure the level of β-actin protein. CMV immediately early antigen (IE) in HF cells was analyzed by indirect immunofluorescence assay. Microfilament alteration was determined by cytoskeleton fluorescence probe. The results showed that CMV IE was observed in more than 95% of HF cells after infection，primarily located in nucleus. HF cells infected by CMV changed from thin shuttle shape to round and thick ball shape，even detached from wall.β-actin got a significant and gradual decreasing of mRNA level in time-dependent manner (P<0.05). Compared with uninfected group，the ex[x]pression of β-actin protein decreased to (74.2±13.4)% at 96 hours after infection (P<0.05). In infected HF cells，microfilaments were ruptured，arranged turbulently，as well as cells merged and fluorescence density of microfilament obviously reduced. It is concluded that cytomegalovirus can induce alteration of actin and microfilament，which may be helpful for CMV to infect，replicate and reactivate in host cells.

　　Key words cytomegalovirus; human embryo fibroblast cell; β-actin; microfilament

　　人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，CMV)属于疱疹病毒家族成员之一，是机会性致病原体。随着异基因造血干细胞移植临床应用日渐广泛，CMV激活感染引发的严重的、致命的并发症已成为造血干细胞移植失败的主要原因之一。人胚成纤维细胞(HF)是CMV的容受性细胞，病毒可在该细胞内活化复制。本研究组已发现CMV可感染多种类型的细胞，并且引起细胞内β-actin mRNA表达的下调[1-3]。本研究旨在探讨CMV对受染细胞β型肌动蛋白水平、微丝骨架功能的影响及效应的时效性，从而进一步认识CMV活化机理。
　　材料和方法
　　材料与试剂
　　CMV AD169病毒株及人胚成纤维细胞系HF细胞由安徽医科大学王明丽教授惠赠，实验前经检测，无其它微生物污染。微丝骨架探针Rhodamine-Phal-loidin(Molecular Probes产品)，鼠抗人CMV即刻早期抗原(IE)单克隆抗体(Novocastra Laboratories产品)，山羊抗小鼠FITC标记二抗(Southern Biotech产品)，山羊抗人β-actin抗体(Santa Cruz产品)，TRIZOL试剂盒(Gibco公司产品)，M-MLV逆转录酶(上海生工公司产品) DMEM培养基及胎牛血清均为Gibco公司产品。
　　CMV病毒株培养
　　HF细胞在含5%胎牛血清的DMEM培养液、5% CO2、饱和湿度、37℃培养箱(Forma Scientific)中培养。AD169病毒在细胞内多次增殖传代以增加病毒毒力，病毒悬液-80℃保存备用。按病毒致细胞病变作用(CPE)终点稀释法在96孔培养板滴定半数组织培养感染量(TCID50)。将10 TCID50的滴度CMV加于培养的单层HF细胞，37℃孵育2小时，用PBS洗涤3次，以新鲜培养液继续分别培养24、48、72和96小时后作相关检测。
　　胞内β型肌动蛋白(β-actin)、甘油醛3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)mRNA表达的RT-PCR检测
　　按TRIZOL试剂盒一步法提取总RNA。紫外分光光度计定量，要求吸光度A260/A280比值在1.8-2.0之间。提取物经甲醛变性凝胶电泳证实为完整RNA。M-MLV RT逆转为cDNA。β-actin及GAPDH 引物根据基因库提供的基因全序列，经计算机软件Pri-mer 3设计，由上海生工生物工程有限公司合成。β-actin引物序列及产物大小：上游引物：5’-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3’;下游引物：5’-GTCACGCACGATTTCCCGCT-3’(扩增产物612 bp);GAPDH引物序列及产物大小：上游引物：5’-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3’;下游引物：5’-AGGGGTCTACATGGCAAGTG-3’( 扩增产物240 bp)。反应体系包括：逆转录反应产物2 μl、25 pmol/L上游及下游引物各0.5 μl、10 mmol/L dNTP 0.5 μl、10×PCR缓冲液25 μl、25 mmol/L MgCl2 1.5 μl、Taq DNA聚合酶U。灭菌去离子水补至终体积数为25 μl。预试验确定产物与循环之间呈线性关系范围。反应条件为： β-actin： 94℃预变性4分钟后，94℃ 30秒，54℃ 45秒，72℃ 60秒，共25个循环，72℃延伸10分钟;GAPDH：94℃预变性5分钟后，94℃ 30秒，58℃ 60秒，72℃ 30秒，共32个循环，72℃延伸10分钟。凝胶成像系统(BIO-RAD)扫描照相。
　　细胞内β型肌动蛋白水平 Western blot检测
　　收集细胞，提取蛋白质(蛋白裂解液含50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，01% SDS，2 mmol/L EDTA，同时加入蛋白酶抑制剂PMSF 100 mg/L，aprotinin 1 mg/L)，考马斯亮蓝蛋白质定量。制备12% SDS聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样40 μg。电泳后用电转移仪转移至硝酸纤维素膜，室温下5%脱脂奶粉封闭2小时，加入1∶500一抗β-actin抗体，4℃孵育12小时，加入1∶1 000相应二抗，室温孵育45分钟，应用ECL化学发光剂在X线胶片上曝光后显影、定影。
　　病毒即刻早期抗原(IE)及微丝骨架荧光探针双标记实验

　　不同处理组HF细胞接种于带盖玻片的6孔培养板中，至确定时间之后，经预温PBS轻轻洗涤2次，37%甲醛室温固定10分钟，用PBS复洗3次，置于含0.1% Triton X-100的PBS液中5分钟，然后沥干水分(勿干燥)，每张盖玻片上加100 μl小鼠源抗IE单克隆抗体工作液(含1%小牛血清白蛋白)，室温潮湿暗盒中静置30分钟，加入1∶100稀释的山羊抗小鼠FITC标记二抗，静置30分钟。洗去荧光染料后加入100 μl Rhodamine-Phalloidin，室温避光20分钟，PBS洗涤后观察实验结果。
　　激光共聚焦显微镜(Zeiss 510)成像及数据分析
　　以488 nm激发光检测FITC标记绿色荧光，545 nm激发光检测罗丹明标记红色荧光，同一指标采用完全一致成像系统参数设置，以保证准确的阳性信号荧光强度。
　　统计学分析
　　应用SPSS 10.0统计软件进行分析处理。数值以均数±标准差(X±SD)表示，两样本的均数比较采用t检验。
　　结果

　　CMV高效感染HF细胞

　　10 TCID50滴度的CMV感染HF细胞，经间接免疫荧光试验证实，95%以上细胞表达病毒IE抗原，主要位于胞核中，胞浆中亦有少量分布(图1)。
　　CMV致HF细胞形态学变化

　　正常生长的HF细胞呈长梭形。CMV 作用24小时后，该细胞由梭形变粗、变圆，甚至脱壁，并且随着时间的延长，CMV滴度的增加，细胞形态变化越明显(图2)。
　　受染细胞内β-actin基因及蛋白质水平均降低
　　未感染组GAPDH/β-actin比值为1.982±0.274，HF细胞受染24小时后，其比值为2.108±0.216，无明显变化(P>0.05);受染72、96小时后，则分别为3782±0.483和4.238±0.394，均显著性低于未感染组(P<0.05);在部分细胞内甚至低于检测水平，表现为渐进性下调(图3A)。胞内β-actin蛋白质水平在受染后24、72小时分别是未感染组的(92.7±11.9)%、(93.3±22.7)%，无显著性差异(P>0.05)，即使提高病毒滴度亦无显著影响(数据未显示);至细胞受染96小时后则为(74.2±13.4)%，显著下降(P<0.05)(图3B)。
　　CMV对细胞微丝骨架影响
　　正常生长状态下，HF细胞内F-actin经荧光标记探针显示呈束状排列，维持正常极性，部分细胞胞膜侧相对深染(图4)。受染48小时后，细胞皱缩，大小不一，形态由细长梭形转变为圆形或椭圆形，部分细胞极不规则。胞内微丝排列紊乱，极性消失，且胞内荧光探针强度减弱，与病毒IE抗原表达丰度呈负相关，表现为较高强度绿荧光的细胞内红色荧光强度较弱。96小时后，细胞融合，表现为多个胞核的重叠积聚，难以辨别细胞形态，F-actin含量明显减少，完整的微丝样结构少见(图2)。双通道扫描显示，位于胞浆内及胞膜侧的CMV IE抗原标记绿色荧光与F-actin探针红色荧光发生融合，显现为橙黄色(图2)。
　　讨论

　　细胞骨架包括微管、微丝和中间纤维，由它们共同组成细胞的支架，成为细胞运动、细胞形态和跨膜信息传递的结构基础。微丝，亦称为纤维形肌动蛋白(F-actin)，是由球形肌动蛋白(G-actin)单体分子形成的多聚体。两者之间的动态平衡在一定程度上维持肌动蛋白功能。β-actin基因编码β型肌动蛋白，系微丝的构成基础。Jones等[4]应用电镜观察发现，CMV感染人HF细胞的同时，伴有细胞骨架破坏和肌动蛋白解聚。Arcangeletti等[5]也发现，CMV在HF细胞中复制时，细胞微管微丝分解，细胞骨架受损。上述研究结果提示，肌动蛋白或微丝骨架可能是CMV感染的主要靶向细胞骨架成分。在本实验中发现，感染CMV的HF细胞形态发生明显的改变，如细胞变粗、变圆，甚至脱壁，微丝断裂、减少，排列紊乱等。同时在受染早期细胞内β-actin基因转录水平即mRNA相对表达量减少，β型肌动蛋白含量在感染晚期下调。因此推测，CMV破坏细胞骨架途径之一可能是通过干扰β-actin基因转录及翻译过程，从而减少肌动蛋白合成或破坏微丝形成。
　　已有研究提出，G-actin 是β-actin基因转录的负调控因素，可降低其稳定性，而F-actin则无此作用[6，7]。本研究发现，CMV感染的HF细胞中，β-actin基因表达随感染时间延长，呈现渐进性下调，甚至低于检测水平。病毒感染HF细胞的早期影响β-actin mRNA水平表达，它可能通过介导肌动蛋白微丝聚合异常导致胞浆内G-actin蛋白含量升高，反馈性降低β-actin mRNA水平;而感染后期，如96小时后，受染细胞内不仅F-actin荧光强度减弱，肌动蛋白含量也有下降。此时细胞内的β-actin mRNA水平显著降低，这说明此时肌动蛋白基因水平下降可能是由于病毒直接作用所致，与G-actin间接调控作用关系并不密切。
　　许多病毒的侵袭、复制等过程均与宿主肌动蛋白骨架体系有关，人类副流感病毒3附着在胞质肌动蛋白纤维上进行转录和复制[ 8 ]。文献报道，CMV IE抗原调控受染细胞的生长与增殖[ 9 ]。病毒IE抗原表达量与细胞内F-actin荧光强度呈负相关，这间接说明病毒复制对肌动蛋白合成或者微丝功能有影响，尽管本实验没有直接证据明确IE抗原在此过程中的作用，但是双通道荧光扫描结果显示，位于胞浆中的IE抗原与F-actin发生部分融合，提示病毒有可能参与微丝聚合与解聚动态平衡过程。当然，微丝骨架对于病毒的复制和活化也可能起到一定的辅助作用。
　　总之，CMV可能通过直接调控β-actin mRNA的转录，也有可能影响肌动蛋白微丝的组装、重排，调节胞内G-actin蛋白含量间接地调控β-actin的基因表达。因此，在感染的不同时期，上述途径发挥的作用可能有所不同。进一步的深入研究将有助于探讨CMV的免疫逃逸机制及进一步认识CMV活化机理。
　　【参考文献】
　　1 魏国庆，林茂芳，黄河等. 巨细胞病毒对多发性骨髓瘤细胞系KM3细胞的感染及其对IL-6 mRNA表达的影响. 中华血液学杂志，2004; 10: 596-599

　　2 魏国庆，林茂芳，黄河等. 人巨细胞病毒对骨髓间充质干细胞的感染及其凋亡诱导作用. 中华血液学杂志，2004; 11: 683-685

　　3 Lin MF，Wei GQ，Huang H，et al. Human cytomegalovirus induces alteration of beta-actin mRNA and microfilaments in human embryo fibroblast cells. J Zhejiang Univ Sci，2004; 5: 733-737

　　4 Jones NL，Lewis JC，Kilpatrick BA，et al. Cytoskeletal disruption during human cytomegalovirus infection of human lung fibroblasts. Eur J Cell Biol，1986; 41: 304-312

　　5 Arcangeletti MC，Pinardi F，Medici MC，et al. Cytoskeleton involvement during human cytomegalovirus replicative cycle in human embryo fibroblasts. New Microbiol，2000; 23: 241-256

　　6 Lyubimova A，Bershadsky AD，Benzeev A，et al. Autoregulation of actin synthesis responds to monomeric actin levels. J Cell Biochem，1997; 65: 469-478

　　7 Bubb MR，Spector I，Bershadsky AD，et al. Swinholide A is a microfilament disrupting marine toxin that stabilizes actin dimers and severs actin filaments. J Biol Chem，1995; 24; 270: 3463-3466

　　8 Gupta S，De BP，Drazba JA，et al. Involvement of actin microfilaments in the replication of human parainfluenza virus type 3. J Virol，1998; 72: 2655-2662

　　9 Castillo JP，Yurochko AD，Kowalik TF，et al. Role of human cytomegalovirus immediate-early proteins in cell growth control. J Virol，2000; 74: 8028-8037.