蝎素组分Ⅲ对Jurkat E61细胞中LAT和SLP76表达的影响

作者：吴子钊　　作者单位：新乡医学院医学检验系，河南 新乡 453003

　　【摘要】 目的 研究蝎素组分Ⅲ(SVCⅢ)对Jurkat E61细胞LAT和SLP76表达的影响，并探讨SVCⅢ参与细胞免疫调控的可能机制。方法 不同浓度SVCⅢ(100 ng•mL-1、10 ng•mL-1、1 ng•mL-1、0.1 ng•mL-1)与植物凝集素(PHA)共同刺激培养Jurkat E61细胞。72 h后收获细胞，利用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术检测细胞内信号分子LAT和SLP76 mRNA表达变化情况。结果 高浓度SVCⅢ(100 ng•mL-1)明显抑制Jurkat E61细胞LAT 和SLP76的mRNA的表达(P<0.05)，低浓度SVCⅢ(0.1 ng•mL-1、1 ng•mL-1、10 ng•mL-1)对Jurkat E61细胞LAT和SLP76的mRNA的表达没有明显作用(P>0.05)。结论 SVCⅢ能够抑制Jurkat E61细胞LAT和SLP76的表达，在一定程度上阻止T细胞信号进一步的传递，从而抑制Jurkat E61细胞的活化能力。并且SVCⅢ可抑制PHA诱导的Jurkat E61细胞的活化，其作用机制可能与早期活化相关的LAT和SLP76等的表达相关。
　　【关键词】 蝎素组分Ⅲ Jurkat E61 LAT SLP76

　　Effects of SVCⅢ on the ex[x]pression of LAT and SLP76 in Jurkat E61 cells WU Zizhao,HU Zhijun,ZHANG Jingjing,et al(Department of Laboratory Medicine,Xinxiang Medical University,Xinxiang 453003,China)

　　Abstract: ob[x]jective To investigate the effects of SVCⅢ on the ex[x]pression of LAT and SLP76 in Jurkat E61 cells and to probe the possible mechanism of cell immunoregulation of SVCⅢ.Methods Jurkat E61 cells were stimulated and cultured by phytohemagglutinin (PHA) and SVCⅢ with different concentration(100 ng•mL-1、10 ng•mL-1、1 ng•mL-1、0.1 ng•mL-1).The ex[x]pression of intracelluar signaling molecule of LAT and SLP76 mRNA was detected by RTPCR.Results Hypsoconcentration SVCⅢ(100 ng•mL-1)obviously inhibited the ex[x]pression of LAT and SLP76 mRNA in the Jurkat E61(P<0.05),while hypoconcentration SVCⅢ(10 ng•mL-1、1 ng•mL-1、0.1 ng•mL-1)had no obvious effect on the ex[x]pression of LAT and SLP76 mRNA in the Jurkat E61 cell(P>0.05).Conclusion SVCⅢ can inhibit the ex[x]pression of LAT and SLP76 in Jurkat E61 cell,and to some extend interrupt the signal transmission of T lymphocyte,and as a result inhibit the activation of Jurkat E61.SVCⅢ can inhibit the activation of Jurkat E61cells by PHAinduced,and it could be related to the ex[x]pression of LAT and SLP76.

　　Key words: scorpion venom crude Ⅲ;Jurkat E61; LAT;SLP76

　　近年来，生物毒素对肿瘤细胞的抑制作用日益受到研究者关注。全蝎作为我国传统中药，千百年来有大量的临床应用，目前蝎毒也备受关注，国内研究主要集中在蝎素对带瘤小鼠肿瘤细胞的杀伤作用。诸多研究表明蝎素不但具备细胞毒性作用,促进T淋巴细胞的转化和肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factorα，TNFα)的分泌[1]，还有重要的生物应答调节作用。蝎素组分Ⅲ ( scorpion venom crude Ⅲ,SVCⅢ) 是从河南马氏钳蝎毒中分离纯化出来的一种活性成分。本研究以Jurkat E61细胞作为研究对象，研究SVCⅢ对T淋巴细胞免疫功能的影响，观察SVCⅢ对Jurkat E61细胞LAT和SLP76(src homologydomaincontaining leukocyte protein of 76 kDa)的 mRNA的表达的影响，并探讨SVCⅢ参与细胞免疫调控的可能机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料 Jurkat E61细胞系购自ATCC公司，PCR扩增仪为Biometra 公司产品，SVCⅢ由新乡医学院分析测试研究室提供，RPMI1640培养液购自GIBCO公司，Trizol试剂盒为Gibco公司产品，LAT基因引物、SLP76基因引物和βactin引物均由北京赛百胜生物技术公司合成。
　　1.2 实验方法

　　1.2.1 细胞培养 Jurkat E61接种于25 mL培养瓶中，用体积分数10%小牛血清的RPMI1640培养，并加入100 U•mL-1的青霉素和100 U•mL-1的链霉素，在温度37 ℃、体积分数5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
　　将处于对数生长期的Jurkat E61细胞分装于24孔培养板中，每孔数量达5×106～10×106•mL-1。分组：空白对照组;植物凝集素(phytohemagglutinin，PHA)(50 μg•mL-1)阳性对照组;SVCⅢ(0.1 ng•mL-1)+PHA刺激组;SVCⅢ(1 ng•mL-1)+PHA刺激组;SVCⅢ(10 ng•mL-1)+PHA刺激组;SVCⅢ(100 ng•mL-1) + PHA刺激组。在37 ℃、体积分数5% CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养72 h收获细胞，每孔重复3次。
　　1.2.2 总RNA的提取 各组按Trizol试剂盒(Gibco公司产品)说明书操作提取总RNA。
　　1.2.3 cDNA的合成 各样本取1 μg RNA用逆转录试剂盒(Promega,USA)合成cDNA。
　　1.2.4 聚合酶链反应 各取cDNA 1 μL为模板，10×BV 2.5 μL，DMSO 1.5 μL，10 mmol•L-1dNTPs 2.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，目的基因正义链及反义链各1 μL，在25 μL的体系中聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增LAT和SLP76。 PCR条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃复性2 min，扩增40个循环，后延长5 min。以βactin为内参照。
　　1.2.5 PCR产物的检测 取RTPCR产物在质量分数2%的琼脂糖凝胶电泳(5 V•cm-1×45 min)成像，与Marker对照观察并用band lander 3.0软件进行灰度分析，计算各刺激组中目的基因与内参照βactin电泳条带平均吸光度的比值，然后各刺激组间进行比较。
　　1.3 统计学处理 测定值以±s表示，应用统计软件SPSS 10.0软件包进行数据处理，组间比较用t检验，P<0.05为差异显著。
　　2 结果

　　2.1 Jurkat E61细胞株中LAT mRNA的检测 经RTPCR扩增，各组LAT mRNA在琼脂糖凝胶电泳成像，结果显示扩增片断与预期设计的片断长度一致，扩增片断约为388 bp左右，见图1。
　　2.2 Jurkat E61细胞株中SLP76 mRNA的检测 经RTPCR扩增，各组SLP76 mRNA在琼脂糖凝胶电泳成像，结果显示与预期设计的片断长度一致，扩增片断约为426 bp左右，见图2。
　　2.3 各组LAT和SLP76 mRNA表达的比较 经凝胶图像分析系统扫描分析， SVCⅢ(0.1 ng•mL-1、1 ng•mL-1、10 ng•mL-1) 组刺激Jurkat E61细胞表达LAT mRNA和SLP76 mRNA的灰度比值与PHA阳性对照组比较没有明显差异(P>0.05);而SVCⅢ(100 ng•mL-1) 组刺激Jurkat E61细胞表达LAT mRNA和SLP76 mRNA的灰度比值均明显低于PHA阳性对照组(P<0.05)，见表1。表1 各组LAT和SLP76 mRNA的表达与PHA阳性对照组比较aP<0.05。
　　3 讨论

　　Jurkat E61细胞是人类T淋巴肿瘤细胞的细胞株，在功能上与人类T淋巴细胞有很多共同的特点，已广泛用于实验室研究。本研究以Jurkat E61细胞作为研究对象，观察SVCⅢ对Jurkat E61细胞LAT、SLP76 mRNA表达的影响，并探讨SVCⅢ参与细胞免疫调控的可能机制。
　　T淋巴细胞的活化需要双信号的刺激，第1信号来自T细胞受体(T lymphocyte receptor，TCR)与抗原特异性的结合，即T淋巴细胞对抗原的识别;活化的第2信号来自协同刺激分子，即抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)上的协同刺激分子与T淋巴细胞表面相应受体的相互作用。 APC将肽MHC复合物提呈给T淋巴细胞，TCR特异性识别结合在主要组织相容性复合物(major histocompability complex，MHC)分子槽中的抗原肽，启动抗原识别信号(即信号)。TCR活化信号向胞内的传导有2条主要途径：PLCg途径和MAP激酶活化途径，而在这2条途径中都存在一个非常重要的环节：活化信号要依靠激活的ZAP70磷酸化接头蛋白LAT和SLP76进行进一步的传递。所以，LAT和SLP76是T淋巴细胞活化过程中非常重要的信号转接蛋白，其表达量的减少，在一定程度上阻止T 细胞信号进一步的传递，从而抑制T淋巴细胞的活化能力。
　　LAT初从活化的Jurkat细胞系细胞膜中纯化到的一种与T细胞活化有关的蛋白质，主要表达于T细胞、NK细胞、血小板和肥大细胞，B细胞和单核细胞不表达。LAT是一种Ⅰ型膜本体蛋白,包括较短的N端胞膜外区、跨膜区和较长的胞浆区。实验证明LAT在早期信号传导中发挥重要作用，LAT可以作为一个信号平台整合和分配从TCR传出的信号[23]。SLP76是1个相对分子量为76 000，SH2结构域的蛋白。SLP76基因主要在T细胞、B细胞和自然杀伤细胞中表达[4]。SLP76初是作为酪氨酸蛋白激酶的底物被发现的，后来研究发现SLP76具有衔接子或支架蛋白的功能，在T细胞系中，高表达的SLP76可增加TCR,从而激活IL2启动子，并在促进淋巴细胞发育[5]、活化肥大细胞和血小板的过程中发挥重要的作用。SLP76作为信号转导蛋白在许多信号转导过程中发挥着不容忽视的作用，它不仅在T细胞激活中发挥重要作用，而且还介导T细胞生长发育过程中的多个信号转导过程[67]。
　　总之，本研究从分子水平上对SVCⅢ在Jurkat E61细胞活化中的作用进行研究，结果表明高剂量SVCⅢ(100 ng•mL-1)对Jurkat E61细胞活化作用有显著的抑制作用，而低剂量SVCⅢ(10 ng•mL-1、1 ng•mL-1、0.1 ng•mL-1)对Jurkat E61细胞活化作用没有明显抑制作用。LAT和SLP76表达量的减少，在一定程度上阻止T 细胞信号进一步的传递，从而抑制Jurkat E61细胞的活化能力，这可能是SVCⅢ免疫抑制作用的机制之一。SVCⅢ对Jurkat E61细胞活化信号通路确切作用的靶点还有待进一步研究。
　　【参考文献】
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