高白细胞性白血病的生物学特性研究

作者：吴辉菁,陈燕　　作者单位：华中科技大学附属协和医院血液科，武汉 430022

　　【摘要】 本研究探讨高白细胞性白血病(HAL)的生物学特点及其临床意义。采用CD45/SSC双参数散点图设门，应用三色流式细胞术，对48例HAL患者及73例NHAL患者骨髓标本进行免疫分型，并对其中74例进行核型分析。结果表明：HAL组骨髓象中红系比例明显低于NHAL组，差异具统计学显著意义(P<0.05);AML中HAL组CD14阳性率明显高于NHAL组，差异具统计学显著意义(P<0.05);ALL中HAL组CD8阳性率明显高于NHAL组，而CD22，cCD79a明显低于NHAL组，差异具统计学显著意义(P<0.05);HAL组与NHAL组在系列抗原专一表达及交叉表达上无统计学差异(P>0.05);HAL缓解率低于NHAL。结论：HAL比NHAL骨髓受抑程度更重，AML中单核细胞性白血病发生高白细胞性白血病的可能性高，ALL中HAL比NHAL更易于表达T系抗原，HAL的白血病细胞较NHAL处于更早分化阶段，同时HAL预后不佳。

　　【关键词】 高白细胞性白血病

　　Abstract The study was to investigate the biological characteristics of hyperleucocyte acute leukemia (HAL) and its clinical significance. Immunophenotyping was performed in 48 HAL patients and 73 NHAL patients by three-color flow cytometry analysis using CD45/SSC gating，meanwhile the cytogenetic analysis was performed in 74 patients. The results showed that as compared with NHAL group，HAL group had lower proportion of eryth-lineage in bone marrow (P<0.05); in AML，the CD14 ex[x]pression of HAL group was apparently higher than that of NHAL group (P<0.05); in ALL，HAL group had higher ex[x]pression of CD8 and lower ex[x]pression of CD22，cCD79a compared with NHAL group (P<0.05); the two groups had no significant difference in ex[x]pression of special lineage antigens and overlapping lineage antigens (P>0.05). The CR rate of HAL group was lower than that of NHAL group. It is concluded that bone marrow inhibition of HAL group is more severe than that of NHAL group. In AML，monocytic leukemia is easier to become into HAL than other leukemias. In ALL，T-lineage antigens of HAL group are more easily expressed than those of NHAL group; the leukemia cells of HAL group are naiver than those of NHAL group，meanwhile the prognosis of HAL is poor.

　　Key words hyperleucocyte acute leukemia; leukemia; immunophenotype

　　急性白血病外周血象中白细胞计数超过100×109/L时称为高白细胞性白血病(hyperleukocytic acute leukemia，HAL)，约占急性白血病的5%-20%[1]，其起病急骤，进展迅速，缓解率相对较低[2，3]，属急性白血病中的高危类型。为进一步了解其恶性本质，现对1组高白细胞性白血病患者的生物学特点进行研究，希望能为高白细胞性白血病的临床治疗及预后分析提供参考。

　　材料和方法

　　病例

　　48例患者均为我院住院病人，均按我国AL诊断标准[4]明确诊断，以外周血WBC≥100×109/L者作为研究对象。48例中男32例，女16例，年龄2-71岁，中位年龄23岁。AML 26例，其中M1 5例，M2 7例，M3 3例，M4 2例，M5 9例。ALL 22例，其中L1 3例，L2 19例。另选同期住院的73例非高白细胞急性白血病(non-hyperleukocytic acute leukemia，NHAL)患者作为对照组，其中男40例，女33例，年龄2-79岁，中位年龄19岁。AML 41例，其中M1 8例，M2 16例，M3 9例，M4 2例，M5 6例。ALL 32

　　例，其中L1 5例，L2 24例，L3 3例。

　　形态学及细胞化学染色

　　骨髓及外周血涂片经瑞氏染色分类计数，经髓过氧化物酶(MPO)，氯醋酸AS-D奈酚酯酶(CE)、酸性非特异性酯酶(ANAE)及糖原(PAS)染色检查，采用FAB分类标准确定各例急性白血病的类型。

　　免疫分型检测

　　取肝素抗凝骨髓液2 ml，经淋巴细胞分离液分离获取单个核细胞，采用直接免疫荧光技术三标记法分析，以CD45/SSC双参数散点图设门，测定结果采用CellQuest软件进行分析。流式细胞仪为FACS Calibur，以FITC、PE、PRECP作为荧光剂标记抗体。单克隆抗体的选择包括髓系相关的CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、CD117、Mpo;T系相关的CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8;B系相关的CD10、CD19、CD20、CD22、cCD79a，干/祖细胞系的CD34、HLA-DR(以上试剂，仪器均由美国Becton Dickinson公司生产)。结果判断：通过CD45/SSC设门识别白血病幼稚细胞，分析计算该幼稚细胞群中各白血病相关抗原的阳性率;除MPO≥10%为阳性外，其他抗原阳性率以≥20%计算为阳性。

　　细胞遗传学检测

　　均采用骨髓细胞直接法，按常规收获骨髓细胞制备染色体标本进行G显带处理，根据《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN)》的规定行核型分析。

　　治疗方案

　　HAL组中12例曾进行白细胞单采术，次数为1-3次，其中3例单采3次后WBC仍大于100×109/L，其余白细胞增高均得到纠正。36例用羟基脲和(或)环磷酰胺预处理，其中4例至出院时WBC未降至50×109/L以下，其余在3-14天内WBC小于50×109/L，中位时间为5天。HAL组中，33例进行联合化疗，NHAL组中，67例进行联合化疗。AML中除M3用维甲酸和(或)亚砷酸治疗外，其余主要以DA或IA方案。ALL主要以DVCP或DVLP方案化疗。疗效判定按全国统一标准[4]。HAL组化疗后6例至出院(死亡)时始终处于骨髓受抑阶段，其余病人骨髓受抑中位时间为10天(5-15天)，NHAL组化疗后骨髓受抑中位时间为10天(3-18天)，两组比较无统计学差异。

　　统计学分析

　　对统计数据进行t检验，χ2检验。

　　结果

　　外周血象及骨髓象

　　HAL组治疗前白细胞计数中位值为146.7×109/L[(100.0-563.3)×109/L]，NHAL组为10.13×109/L[(0.6-86.7)×109/L]，两组比较差异有显著性(P<0.05);HAL组血红蛋白计数中位值为70 g/L(43-129 g/L)，NHAL组为71 g/L(3.8-123 g/L)，两组比较差异无显著性 (P>0.05);HAL组血小板计数中位值为40×109/L[(8-338)×109/L]，NHAL组为37×109/L[(6-666×)109/L]，两组比较差异无显著性(P>0.05)。骨髓象中原始+幼稚细胞数，HAL组中位值为84.5%(50.5%-99.0%)，NHAL组为83.0%(21.5%-97.5%)，两组比较差异无显著性(P>0.05);红细胞比例HAL组中位值为1%(0.5%-13.0%)，NHAL组为3.25%(0.5%-48.5%)，两组比较差异有显著性(P<0.05)。

　　HAL与NHAL组免疫表型的比较

　　HAL组及NHAL组均做过免疫分型检测。结果显示，M1中5例HAL及8例NHAL的髓系抗原阳性率高者均为CD33()，而CD13、CD15、MPO阳性率均超过50%;但NHAL中CD117阳性率()高于HAL组(40%)。淋系抗原中，HAL组CD4、CD19阳性率高(40%)，而NHAL中CD4、CD7为高(37.5%)。

　　M2中7例HAL的髓系抗原以CD13阳性率高()，而16例NHAL的髓系抗原以CD33、CD117、MPO同为高(93.8%)，在两组中除CD11b及CD14外，其余抗原阳性率均超过50%。淋系抗原中，HAL组CD4，cCD79a阳性率高，但也仅28.6%;NHAL组中CD4阳性率高(56.3%)，其余抗原阳性率均低于50%。

　　M3中3例HAL及9例NHAL的髓系抗原以CD33阳性率均为高()，但HAL组中CD117亦达;而NHAL组中CD13阳性率则为，另外两组中，除CD11b，CD14外，CD15阳性率亦低于50%。淋系抗原中，HAL组除CD4有2例阳性表达外(66.7%)，其余抗原均无人阳性表达;而NHAL组中仅CD2，CD4，CD22各有1例阳性表达(11.1%)。

　　M4中2例HAL的7种髓系抗原阳性率均为;2例NHAL中除Mpo为50%，CD14无1例阳性表达外，其余抗原阳性率亦为。淋系抗原中，HAL组及NHAL组均全部表达CD4()，而CD2在NHAL组有1例阳性表达(50%)。

　　M5中9例HAL及6例NHAL的髓系抗原阳性率高者均为CD33()，另HAL组除Mpo外，其余抗原阳性率均>50%。NHAL组中，除CD14外，其余抗原阳性率均>50%。淋系抗原中，HAL组及NHAL组中仅见CD4表达阳性率>50%，分别为88.9%及。

　　所有AML中，26例HAL及41例NHAL，髓系抗原阳性率高者皆为CD33(92.3%，97.6%)，而CD13、CD15、CD117、Mpo阳性率均大于50%;HAL组CD14阳性率(30.8%)明显大于NHAL组(4.9%)，差异具有显著性(P<0.05)。 淋系抗原中，除CD4阳性率在两组中均>50%(61.5%，51.2%)外，其余均<20%。干/祖细胞系抗原中，除M3型较为特殊，HAL组仅1例表达HLA-DR，NHAL组仅1例表达CD34外，这两种抗原无论在HAL组还是NHAL组，在各型AML中的阳性率均大于50%。AML中HAL组与NHAL组抗原表达情况与CR的关系.

　　ALL-L1中，3例HAL中有2例T系6种抗原阳性率均为66.7%;5例NHAL中，CD2，CD5，CD7阳性率高，但也仅40%。B系抗原中，HAL组仅CD19有1例阳性表达(33.3%)，而NHAL组中CD10，CD19，cCD79a阳性率均为高(80%)。髓系相关抗原中，HAL组除CD13，CD15，CD33各有1例呈阳性表达外(33.3%)，其余抗原均无1例阳性表达;NHAL组CD11b阳性率高，但也仅40%。干/祖细胞系抗原中，HAL组CD34，HLA-DR阳性率均为33.3%;NHAL组CD34阳性率为80%，高于HLA-DR(60%)。

　　L2中，19例HAL的T系抗原中阳性率高者为CD5，CD7，但也仅36.8%;24例NHAL中，CD4阳性率高，但也仅25%。B系抗原中，HAL和NHAL病例均为CD19阳性率高(84.2%，79.2%)，另HAL中CD10阳性率为68.4%，NHAL中CD10、CD22、cCD79a阳性率>50%。HAL和NHAL组髓系相关抗原中，均为CD13阳性率高(52.6%，50%)。干/祖细胞系抗原中，两组均为HLA-DR阳性率(63.2%，91.7%)高于CD34(57.9%，70.8%)。

　　HAL中无1例L3;NHAL中3例L3均表达B系抗原CD10，CD19()，2例表达CD22，cCD79a(66.7%);无1例表达T系抗原;髓系抗原中仅见1例表达CD33(33.3%)。 干/祖细胞系的抗原中，HLA-DR阳性率()高于CD34(66.7%)。

　　所有ALL中，HAL组T系抗原阳性率高者为CD5，CD7(40.9%)，NHAL组则为CD4(21.9%)。B系抗原在两组均为CD19阳性率高，分别为77.3%，81.3%，另HAL中CD10阳性率>50% (59.1%)，NHAL中CD10，CD22，cCD79a>50%。髓系相关抗原中，HAL组CD13阳性率高，为50%，NHAL组CD33则为高，但也仅40.6%。干/祖细胞系抗原中，两组均为HLA-DR阳性率(59.1%，87.5%)高于CD34(54.5%，71.9%)。另外，HAL组CD8阳性率明显高于NHAL组，而CD22，cCD79a阳性率明显低于NHAL组，且差异均具统计学显著意义(P<0.05)。ALL中，HAL与NHAL组抗原表达情况与CR的关系。

　　HAL的核型特点

　　26例AML高白细胞性白血病患者中，10例做过染色体核型分析，其中6例为正常核型，2例放弃治疗，1例死亡，3例完全缓解。其余4例均为染色体易位，3例为t (15;17)(q22;q11)，1 例完全缓解，2例未缓解;1例为t(8;21)(q22;q22)，放弃治疗。41例非高白细胞性白血病患者中，30例做过核型分析，其中13例为正常核型，11例完全缓解，2例未缓解。6例伴有染色体易位，其中3例为t(8;21)(q22;q22)，均达完全缓解;1例为t(15;17)(q22;q11)，完全缓解;2例为t(9;22)(q34;q11)，1例完全缓解，1例未缓解。另1例为del(17)(q25)，未达完全缓解，1例为dup(1)(q32-41)，完全缓解。其余9例为数目异常，其中除1例放弃治疗，1例+21号染色体患者未缓解外，均达完全缓解。

　　22例ALL高白细胞性白血病患者中，13例做过核型分析，其中6例为正常核型，1例死亡，1例放弃，其余4例均未缓解。3例为染色体易位，分别为t(11;14)(p13;q11)，t(2;16)(p13;q22)，t(9;22)(q34;q11)，均未完全缓解。另4例为染色体数目异常，均完全缓解。32例非高白细胞性白血病患者中，21例做过核型分析，其中15例为正常核型，1例放弃，11例完全缓解，3例未缓解。1例伴染色体易位，为t(9;22)(q34;q11)，未缓解。其余5例为染色体数目异常，均达完全缓解。

　　讨论

　　HAL属急性白血病中的高危类型，易合并颅内出血、梗死、ARDS等危及生命的并发症;化疗过程中大量白血病细胞死亡，易致“肿瘤溶解综合症”，组织凝血因子大量释放，导致DIC发生及一系列代谢异常，从而加重患者病情，故HAL早期病死率较高[3]，预后差。本组资料中，26例AML高白细胞性白血病患者中M5 9例，发生率为34.6%;而NHAL的41例AML中M5仅为6例，发生率为14.6%，提示M5型发生高白细胞性白血病可能性大，但差异无统计学显著意义，国内亦未见相关报道。在血象与骨髓象检查中，HAL与NHAL在外周血血红蛋白量、血小板计数及骨髓中原始细胞+幼稚细胞数方面均无显著差异，但HAL组骨髓中红系比例明显低于NHAL组，提示HAL骨髓受抑程度较NHAL为重。

　　HAL免疫学特点尚未引起其他人注意，通过CNKI检索，1997年至今国内尚无人报道。AML中，无论是HAL还是NHAL，髓系抗原表达阳性率高均为CD33、CD13均高于文献中Drexler[5]总结的758例AML中的表达率(81%，84%)，但HAL和NHAL之间其表达并无明显差异。所以这两种抗原作为髓系的特异性抗原较为可靠，但在HAL与NHAL的比较上没有意义。CD14是髓系单核细胞相关性抗原，且被认为属预后较差的免疫表型，国内外报道在AML中的表达率约为20%左右[5]，在所有67例AML中，其表达阳性率为14.9%，本研究与此报道较为一致。但在HAL中，其阳性率高达30.8%，高于NHAL组的4.9%，且差异具有统计学显著意义，与前述M5型发生高白细胞性白血病可能性大刚好对应;即使单独在M4，M5两型中比较，CD14阳性率在HAL组也高于NHAL组，与前文所述HAL预后不佳亦刚好相符。

　　ALL中，无论是HAL组还是NHAL组，淋系相关抗原中阳性率高的均为CD19，CD10，此2种抗原均为B系抗原。从表1、表2也可看到B系抗原在2组中阳性表达率均明显高于T系抗原，说明ALL中，B-ALL的比例高，与文献[6，7]报道一致，但就在HAL与NHAL两组之间的比较来说，B系抗原的表达并无明显差异。另外，因为ALL-L1，HAL组主要表达T系抗原，而NHAL则主要表达B系抗原，是否提示，L1中T-ALL发生高白可能性高于B-ALL，但因病例数较少，差异无统计学显著意义。

　　HAL中CD8阳性率明显高于NHAL组，而CD8是特异性的T细胞表面标记;另HAL中CD22，cCD79a的阳性率明显低于NHAL组，而CD22，cCD79a均为较成熟的B细胞标记。以上两者综合起来，说明HAL比NHAL更易于表达T系抗原;而且HAL中，白血病细胞较NHAL组处于更早分化阶段。

　　Ferrare等[8]对417例AML及370例ALL进行免疫分型，AML中系列专一性表达为65%，ALL为85%;交叉表达在AML中有31%，ALL有15%，其余为“裸细胞型”。但在本研究资料中，HAL组与NHAL组系列专一性表达均低于此报道，且HAL组更为明显，这可能与检测方法阳性判断标准差异有关。虽然HAL组系列专一性表达率低于NHAL组，但2组差异并无统计学意义。而交叉表达中，多数是伴T系抗原表达，且多为CD4阳性，而CD4在M5中的阳性率在HAL组高达88.9%，在NHAL组更达，与王兴兵等研究结果一致[9];若将CD4不包括在T系抗原中，则HAL组仅3例伴T系抗原表达，NHAL组也从26例减至11例，故CD4作为T系的特异性抗原应有所保留。但是即使不将CD4包含在T系抗原中，HAL与NHAL组伴T系抗原表达者差异亦无统计学意义。

　　ALL中，专一表达淋系抗原比例也明显低于上述报道，和AML组相同，HAL组系列专一性表达者比例亦低于NHAL组，但2组差异无统计学意义。而在髓系抗原中，HAL组CD13阳性率高，NHAL组CD33阳性率高，但这2种抗原在2组中的表达差异亦无统计学意义。

　　AML中，HAL组专一表达髓系抗原CR率高于交叉表达者;ALL中专一表达B系抗原与伴髓系抗原表达者CR率相当，但有T系抗原表达者无1例达完全缓解，提示AML中HAL患者专一表达缓解率高;而ALL中无T系抗原表达缓解率高，但因病例数较少，差异无统计学显著意义。

　　据文献[10]报道，在AL细胞遗传学分析中，预后好的核型有t(8;21)，inv(16);其次为t(15;17)和正常核型。预后较差的不良核型有-5/5q-，-7/7q-，inv(3q)，11qabn，17qabn/I(17q)，del(20q)，完整的8，11，13，14号染色体三体，复杂的核型异常及del(16)(q22)等。在本研究中，无论是HAL组还是NHAL组，均未见与上述报道相关的不良核型，但即使同为预后较好的核型，HAL组的CR率亦低于NHAL组。26例AML高白细胞性白血病患者中，14例经过联合化疗，7例达到完全缓解，缓解率为50%;41例非高白细胞性白血病患者中，36例经过联合化疗，26例达到完全缓解，缓解率为72.2%。22例ALL高白细胞性白血病患者中，19例经过联合化疗，7例达到完全缓解，缓解率为36.8%;32例非高白细胞性白血病患者中，31例经过联合化疗，23例达到完全缓解，缓解率为74.2%。结合表1，表2也可以看到，无论在哪一种分类，HAL组缓解率均低于NHAL组，进一步验证了高白细胞性白血病的预后不佳。

　　【参考文献】

　　1曾宾，魏菊荣. 高白细胞急性白血病50例分析.临床内科杂志，2000; 17: 241-242

　　2陆道培.白血病治疗学.北京：科学出版社，1992: 78-81

　　3尹芳，孟凡义，周淑云等. 高白细胞急性白血病预后的因素分析. 白血病，2000; 9: 296-297

　　4张之南，沈悌，主编.血液病诊断及疗效标准.第2版.北京:科学技术出版社，1998:184-214

　　5方美云，沈悌，王一.急性白血病免疫分型及交叉表达的临床意义.白血病•淋巴瘤，2003; 12:267-270

　　6Czuczman MS，Dodge RK，Stewart CC，et al. Value of immunophenotype in intensively treated adult acute lymphoblastic leukemia: cancer and leukemia group B study 8364. Blood，1999; 93: 3931-3939

　　7秘营昌，卞寿庚，陈桂彬等. 成人急性淋巴细胞白血病髓系抗原和CD34表达研究. 中华血液学杂志，1999; 20: 76-78

　　8易雪，邹萍，黎纬明等. 91例急性白血病FCM免疫分型分析.临床血液学杂志，2004; 17:151-153

　　9王兴兵，姚军霞，郑金娥等.115例急性髓细胞白血病多参数流式细胞术免疫表型分析.中国实验血液学杂志，2005; 3: 250-253

　　10Hiddeman W，Kern W，Schoch C，et al. Management of acute myeloid leukemia in elderly patients. J Clin Oncol，1999; 17: 3569-3576