老年患者恶性胸水中肿瘤浸润免疫细胞体外活化

　　作者：黄艳,王红阳,郭继芳,刘飒　　

　　作者单位：华北煤炭医学院附属医院呼吸内科，河北 唐山 063000

　　【摘要】目的观察老年患者恶性胸水中肿瘤浸润免疫细胞的活性。方法分离恶性胸水单个核细胞(PEMCs)，采用两步贴壁法，获得非贴壁细胞，树突细胞及淋巴细胞是其主要功能细胞成分。IL-2活化肿瘤浸润免疫细胞，SP法检测T淋巴细胞亚群的数量及免疫功能，SP法S-100蛋白染色检测树突细胞。结果 IL-2活化培养7 d后肿瘤浸润树突细胞(TIDC)和肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)数量明显增加(P<0.01)。恶性胸水TIDC经过IL-2活化后具有抗原提呈功能。结论 IL-2活化肿瘤微环境中TIDC，使其恢复免疫监视功能，有效地负载肿瘤抗原，协同TIL等其他免疫细胞有效杀伤肿瘤细胞。
　　【关键词】 IL-2;肿瘤浸润树突状细胞;肿瘤浸润性淋巴细胞;恶性胸水
　　【Abstract】 ob[x]jective To observe the activity of tumor infiltrating immunocytes in malignant pleural effusions from old patients.Methods Pleural effusions mononuclear cells (PEMCs) were separated and obtained.IL-2 was used to activate tumor infiltrating immunocytes，SP method was used to detect the number and function of T lymphocytes and S-100 protein was used to examine dendritic cells.Results After activated by IL-2 for 7 days，the number of tumor infiltrating dendritic cells (TIDC) and tumor infiltrating T lymphocytes (TIL) were increased (P<0.01).Activated TIDC had antigen presentation function.Conclusions IL-2 can activate TIDC in tumor microenvironment and recover its immune surveillance function and make it effectively to load tumor antigen and kill tumor cells cooperating with TIL and other immunocytes.

　　【Key words】 IL-2;Tumor infiltrating dendritic cells;Tumor infiltrating lymphocyte;Malignant pleural effusion

　　目前认为肿瘤微环境中抗原提呈细胞及效应细胞是肿瘤微环境的关键细胞，可以发挥免疫监视及清除癌细胞的作用。近年来树突细胞(DCs)作为抗原提呈细胞在机体的抗肿瘤免疫反应中的重要作用日益受到重视，对肿瘤浸润树突细胞(TIDC)的研究证实DCs是肿瘤微环境中的主要抗原提呈细胞，但是无功能或功能低下。有关恶性胸水肿瘤微环境中的TIDC研究较少，目前对恶性胸水中的淋巴细胞的研究颇多，认为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)主要源于T淋巴细胞，IL-2作用下可增殖、分化为细胞毒性T细胞(CTL)。我们选择在体外用IL-2活化恶性胸水免疫细胞，主要针对TIL和TIDC，观察负载肿瘤全抗原后对肿瘤细胞的体外杀伤作用，以期为恶性胸水临床免疫治疗提供实验依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料

　　多种氨基酸培养基(RPMI1640，美国Lifetechnologies公司)。淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque液,上海试剂二厂),IL-2(北京双鹭生物工程制品厂),AB型血清(中国医学科学院天津血液学研究所)。肝素抗凝试剂、人外周血T细胞亚群SAP法检测试剂盒、S-100蛋白SP法检测试剂盒(北京中山生物技术有限公司)。
　　1.2 临床资料

　　选取2003年3月至2007年8月我院诊治的100例肺癌合并恶性胸水老年患者，男50例，女50例。所有病例经胸片、CT及病理学诊断和(或)细胞学检查证实为晚期恶性肺肿瘤合并胸膜转移致胸腔积液患者,同时血性胸水患者不作为研究对象。
　　1.3 方法

　　在无菌操作下抽取患者胸水500 ml，并将其引流进含有肝素(10 U/ml)的无菌盐水瓶内，50 ml离心管分装胸水，1 000 r/min，20℃离心10 min。弃上清，Hanks液洗2遍。取10只10 ml离心管各加淋巴细胞分离液3.5 ml，以1∶1的比例加入HBSS悬浮的细胞，2 000 r/min，20℃离心20 min。吸取白膜层细胞转移至10 ml离心管。1 000 r/min离心10 min。弃去上清，含灭活补体的10%人AB型血清的RPMI1640培养基洗2遍。调整细胞浓度为106/ml接种于6孔板中，每孔加2 ml，置体积分数为0.05的CO2、37℃温箱中培养培养2~3 h。轻轻吸取非贴壁细胞，轻轻洗去残余悬浮细胞，获得先贴壁细胞，所有悬浮细胞共同转移至另一6孔板中再贴壁20 h，再次吸取非贴壁细胞(单核细胞为主)(包括TIDC和TIL)。非贴壁细胞中加入500 U/ml IL-2，每2天传代1次同时补充IL-2，37℃ 5%CO2温箱继续培养，相差显微镜下观察细胞形态。台盼蓝计数细胞并检测细胞活性。细胞培养前后SP法检测T细胞亚群免疫功能及S-100蛋白阳性细胞。S-100蛋白阳性细胞判定标准：光镜下可见胞浆及胞膜出现棕黄色，阳性结果为棕黄色，树突细胞胞浆着色，单核/巨噬细胞染色位于细胞膜。
　　1.4 统计学处理
　　数据以x±s表示，采用SPSS13.0行t检验。
　　2 结 果
　　2.1 免疫组化DAB染色结果判定

　　阳性结果为棕黄色;光镜下可见胞浆及胞膜出现棕黄色，S100阳性DC胞浆着色，单核/巨噬细胞染色位于细胞膜，见图1;活化第7天：DC形态不规则，有长短、粗细不等的突起;核不规则，且多扭曲，胞浆内出现弥漫状或颗粒状棕黄色反应物;胞浆呈分枝状突起，形似树突状，而巨噬细胞出现胞膜棕黄色，图1。
　　2.2 流式细胞仪分析鉴定DC表面分子

　　PEMCs培养前微量CD1a+DC，无CD+83DC。活化TIDC 7 d：出现CD1a+DC和CD+83DC，CD+83是DC的成熟标记，见表1。图1 TIDC光镜下形态(DAB，×400)表1 培养前后DC细胞表型变化

　　3 讨 论
　　肺癌合并恶性胸水临床常见，以胸膜转移为常见原因，这些转移灶从生物学角度看具有异质性，每个灶对抗肿瘤药物的敏感性也存在异质性，单纯化疗除去所有转移灶并不可能。抗原提呈细胞将肿瘤抗原有效地提呈给T淋巴细胞，激活肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对肿瘤细胞的杀伤作用是特异性抗肿瘤免疫的关键环节〔1，2〕。DC是体内功能强的专职抗原提呈细胞，DC仅占外周血单个核细胞总数的0.5%～1.0%，癌肿瘤微环境DCs的数量、功能的研究鲜见报道，TIDC是肿瘤微环境中的主要抗原提呈细胞，可能是一种无功能或功能低下的DC，肿瘤细胞在肿瘤局部分泌的免疫抑制因子可能是导致TIDC功能低下的原因之一，抑制免疫细胞的抗肿瘤免疫应答，研究TIDC对了解肿瘤免疫逃避机制具有重要意义〔3〕。 由于晚期癌症患者全身免疫功能的低下，导致了癌性胸水中的TIL处于免疫抑制状态。现TIL体外活化后其特异性及细胞杀伤活性等已得到临床证实，来自自体肿瘤细胞的TIL对自体肿瘤具有强大的细胞毒作用，对自体正常组织无杀伤性，着肿瘤免疫学的深入，提出了“肿瘤微环境”的概念，由于恶性肿瘤在患者体内生长时能分泌免疫抑制因子，抑制免疫细胞的抗肿瘤免疫应答。因此，如何解除肿瘤细胞的免疫抑制作用，优化机体的特异性抗肿瘤免疫的微环境，提高肿瘤患者机体自身的抗肿瘤免疫应答，是对癌细胞扩散和转移的预防及治疗过程中一个重要的问题。以往的研究发现，IL-2基因修饰的DC免疫治疗后，能优化荷瘤宿主体内抗原提呈的微环境，腔内直接注入TIL，对局部抗肿瘤免疫应答的微环境起到了优化和增强作用，能有效地抑制晚期癌症患者胸水中癌细胞的增长。本文发现IL-2活化TIL的同时，使胸水中的无功能TIDC转变为成熟DC，肿瘤抗原致敏的TIL和TIDC有特异性杀伤作用。本研究结果显示恶性胸水中的TIDC数量极少，经过IL-2活化，T细胞免疫功能明显上调，且对于肿瘤抗原具有特异性杀伤作用。本研究为恶性胸水的临床治疗提供了可靠的实验依据，在临床治疗中将有广阔的应用前景。
　　【参考文献】
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