SHMT1多态性与ALL儿童HD-MTX不良反应的关系

        急性淋巴细胞白血病( ac:ute lymphocytic leuke-mia，ALL)是常见的儿童癌症，占全部儿童恶性肿瘤的30%。随着化学治疗的进步，日前儿童ALL的生存率已达80% - 90%。叶酸拮抗剂甲氨蝶呤( methotrexate．MTX)是儿童ALL主要的化疗药物，现已广泛应用丁其巩同治疗及髓外白血病的防治，并且在治疗过程中取得了娩著疗效。然而，部分个体在用药过程中缺乏疗效或产生严熏的不良反应而未能达到预期效果。因此，如何提高大剂量甲氨蝶呤 （high-dose methotrexate，HD-MTX）的药效并降低其不良反应成为当前治疗儿童ALL的焦点话题。国外有人对MTX代谢的关键酶之一丝氨酸羟甲基转移酶1( serine hydroxymethvltransferase l,SHMTI)基因爹：态性与MTX不良反应的关系做了研究，但其结果存在争议。国内少见到该方面的报道。本实验以深圳地区汉族ALL患儿为研究对象，进一步探讨SHMTI多态性与HD-MTX疗效及不良反应的关系，以期为MTX更有效地应用于临床提供依据。

        1 材料与方法

        I.I研究对象
        深圳市儿童医院2003年3月至2011年6月收治的51例ALL儿童，且均为中国汉族儿童。男35例，女16例，发病年龄6个月- 13岁，平均(5.07+2.83)岁。包括47例B-ALL和4例T-ALL，其中高危10例，中危18例，标危23例：所有患儿经细胞形态学、免疫学和细胞遗传学诊断及分型，其诊断参照国内儿童ALL诊断标准。 该51例ALL儿童包括43例依照G2-2002-ALL化疗方案（广东省改良的BFM-2002-ALL化疗方案）化疗患儿和8例依照GD-2008-ALL化疗方案化疗患儿，均接受HD-MTX加四氢叶酸钙(c:alCium folinate，CF)预防髓外白血病。标、中危（T-AII除外）患儿HD-MTX用量2-3 g/m2，T-ALL和高危患儿HD-MTX用量5 g/m2。所有患儿化疗前查肝肾功能、血常规、 心电图、心肌酶谱等均达化疗要求。HD-MTX用药前预防呕吐治疗，同时每晚睡前Lj服6-巯基嘌呤25 mg/m2．d；用药当天及其后3d大量补液，充分水化及碱化尿液，以减小肾功能损害；用药结束后36h开始行CF解救，减小MTX不良反应。化疗期间用0.1%洗必泰溶液漱口及0.05%利儿诺坐浴，预防口腔黏膜及肛周感染。化疗结束后复查各项常规检查。

        1.2方法
        1.2.1 MTX不良反应评价指标 于HD-MTX用药后2周内或实行下一轮化疗前观察其不良反应，并参照世界卫生组织制订的《抗癌药物急性及亚急性毒性反应分度标准莎（WHO标准）进行评估。0度表示无毒性，1度及2度代表轻度毒性，3度及4度代表严重毒性。抗肿瘤药物应用过程中，现1、2度不良反应在允许范围内；f|I现3度不良反应时，应停止化疗，并进行对症处理及调整用药剂量；出现4度不良反应时，应立即停止化疗及进行救治。为此，本研究中将HD-MTX用药后患儿出现的不良反应按0、1、2、3和4度共5组进行统计。

        1.2.2样本采集经深圳市儿童医院医学伦理委员会批准，患儿监护人知情同意并签字后，于化疗及输血前抽取1.5 mL患儿骨髓液，EDTA抗凝。用QIAamp@ RNA Blood Mini Kit提取mRNA后再经Re-verse Transc:riptase XL试剂盒逆转录获得c:DNA，然后以c:DNA为模板扩增日的基因。

        1.2.3 SHMTI多态性检测 
        用Primer 5.0软件白行设计扩增全长SHMTl c:DNA全编码区和3、一非翻译区的引物以及覆盖该片段的巢式PCR引物，用PCR扩增、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electro-phoresis，DGGE)筛查突变样本后，针对DGGE筛查的突变位点大致cDNA位置设汁测序引物。测序弓I物：上游弓I物为5--GTCAGAGCCACCCTGAAA
G-3-，下游引物为5--AGCCTGGTTGATTCTCACAC-3-，扩增片段长772 bp。PCR扩增体系和扩增条件同文献。 PCR扩增产物检测：取5uL扩增产物与1uL 6x上样缓冲剂混合后，于2%琼脂糖80 V电泳20 min。经凝胶成像系统成像并拍照，与100 bp对照，出现清晰日的条带者送英潍捷基（上海）公司进行测序。测序结果经Chromas软件分析。

        1.3统计学分析 
        用SPSS 13.0软件进行分析数据分析。用基因计数法统计SHMTI多态性位点的基因型及等位基因频率，用X2检验分析51例ALL儿童SHMTI多态性是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡及其与HD-MTX不良反应的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

        2结果
        2.1 HD-MTX不良反应发生情况
        HD-MTX产生的不良反应表现为骨髓抑制（血红蛋白、中性粒细胞、血小板等减少）、肝功能损害、口腔黏膜炎、神经系统症状及恶心、呕吐等消化道症状。本组临床资料中，其严重不良反应主要表现在骨髓抑制和肝功能损害，消化道反应、U腔黏膜炎及神经系统症状多在可免许范围内，未发现明艟肾功能损害（表1）。

        2.2筛查及测序结果

        DNA测序结果与DGGE筛查结果一致。5 1例ALL患儿中，rs3783(C>G)、rs1979276(C>T)、rs12952556(A>G)及rs1979277( C>T)四个基因位点基因型分布情况相同，即为相同的野生、杂合或纯合基因型，且分布频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡(X2=1.768，P=0.184)。野生基因型44例，占86.2%；杂合基因型6例，占1 1.80/c；纯合基因型1例，占2.0%。因此，本文章对SHMT1多态性与MTX不良反应关系的分析均以rs1979277( C1420r)为代表。此外，本实验为分析ALL儿童SHMTI多态性的病例对照研究，该多态性在深圳地区正常中国汉族儿童中的分布、与儿童ALL易感性关系的分析、实验中的DC.GE筛查图像及测序图谱另有文章发表。

        2.3 SHMTI rs1979277多态性与MTX不良反应的关系 基丁样本数苗有限及MTX不良反应的严罩程度，分别对51例ALL患儿SHMTl rs1979277多态性与发生中性粒细胞减少和肝功能损害的病例进行统计学分析。同时南丁决定是否开始新一轮HD_Mrl'X化疗的中性粒细胞低值是0.5x109/L，即《抗癌药物急性及亚急性毒性反应分度标准》3与4度不良反应分界值，故将发生中性粒细胞减少的病例分<4度和4度两组进行分析。经分析发现，rs1979277多态性与发生4度中性粒细胞减少友生风险无关(P>0.05)；rs1979277 CT、TT基因型具有保护作用，可降低肝功能损害的发生风险（P<0.05，表2、表3）。

        3 讨论
        叶酸是维持细胞正常功能的必需营养素，其正常代谢为RNA和DNA合成原料嘌呤和嘧啶的合成、DNA及蛋白质的甲基化等提供一碳供体。MTX通过竞争性抑制叶酸代谢而抑制RNA及DNA合成，进而导致细胞死亡发挥药理作用。然而，在用药过程中，MTX呈现较低的化疗指数，患者对该药的治疗反应存在差异，约1/3患者的治疗失败归因丁缺乏疗效或严重不良反应，HD_Mrrx化疗常常南丁严重不良反应而减少用药剂昔或停止用药。本研究中，HD_Mrrx不良反应表现为血红蛋白、中性粒细胞及血小板减少，肝功能损害，口腔黏膜炎，消化道及神经系统症状。其中以中性粒细胞减少和肝功能损害为严蕈，其他症状多在可允许范围内。尽管在用药过程中均采取了相应的防护及治疗措施，但是不同个体间Mrl'X药效和不良反应的差异性仍是日前临床治疗面临的一大难题。 
        个体问药效的差异性涉及多种因素，包括患者个人因素（年龄、性别、种族、合并症），疾病特异因素（疾病的持续时间、严重程度、活动状况）及基因因素。Yen-Revollo等提出药物代谢酶基因多态性可以解释大部分用药个体间药效和不良反应的差异性。SHMTI作为MTX产生药效的关键酶之一，其常见基因多态性位点rs1979277( C1420T)得到科研工作者的极大关注。既往研究提，与SHMT1420CC和rr基因型相比，Crl基因型ALL患儿HD_Mrrx应用过程中产生较低的肝脏毒性与之相反，Owen等阳1研究Mrl'X治疗的关节炎患者提，SHMrl C1420T多态性与MTX药效和不良反应无关，Slamp等㈨认为SHMT C1420T与Mrl'X代谢产物聚谷氨酸浓度无关，一定意义上亦肯定了Owen等研究结果。此外，有人认为基因多态性所致酶活性的改变只在应用小剂苗MTX时发挥调节作用，不适用ALL时HD-MTX化疗的调节。

        本研究中．rs1979277为代表分析SHMrl'1多态性，其结果屁示c.rr和TT基因 型降低 HD-MTX肝脏毒肚而与中性粒细胞减少无关，由于rs1979277、rs3783、rs1979276、rs12952556的分布情况相同，本研究尚不能定论SHMT1rs1979277多态性与HD-MTX不良反应具有相关性。但由此可推测此四个事态性位点联合作用下，ALL儿童HD-MTX用药后中性粒细胞减少的发生风险无显著变化，它们中的一个或几个基因位点可能降低肝功能损害的发生风险， 新研究报道携带SHMTI内含子rs9909104TC基因型的ALL型儿童较TT基因型者生存率降低，MTX化疗失败可能与化疔前患者叶酸水平相关。据此可以推测，叶酸代谢酶基因内含子的多态性及患者体内叶酸水平可能影响MTX化疗的疗效及不良反应。探讨叶酸代谢酶基因多态性与MTX疗效及不良反应的关系，应加强此两方面内容的研究。 总之，本研究实验路线成熟，实验结果可靠，之前课题组成员对HD-MTX药效及不良反应的研究亦取得定成绩，现对中国汉族ALL儿童SHMTII多态性与 HD-MTX不良反应的关系作出分析：.ALL儿童接爰HD-MTX化疔后产生的严重不良反应主要表现为中性粒细胞减少刊肝功能掘害：rs197927737、rs979276及rs12952556联合作用对中性粒细胞减少无显著影响，但其中一个或几个基因位点可能降低肝脏毒性的粒牛风险，基于单核 甘酸多态性因种族及地区汉族儿童，且样本数量有限，为确定SHMT1多态性能否为判断HD-MTX不良反应的可靠预测因子，仍需要大量临床研究，旨在大限度降低患者用药后的个体差异，使不良反应的发生风险维持在可接受的水平，同时产生大药效。