细菌纤维素膜修复兔硬脑膜缺损的早期观察

        因手术和外伤等原因造成的硬脑膜缺损在临床上相当常见，为防治脑脊液漏和颅内感染，预防脑与周围组织粘连，必须及时实施硬脑膜修补术。目前临床}几使用的人工硬膜材料存在强度差和组织相容性不佳等缺点。 细菌合成纤维素(bacterial cellulose)是一种在醋酸杆菌发酵培养过程中产生的物质，其直径仅为 10 -80 nm,属纳米级纤维。BC具有良好的韧性强度和水合度，有利于组织生长并能够限制感染[3]，这些都是作为人工硬膜材料潜在的有利条件。本研究通过动物实验，应用BC修补新西兰兔硬脑膜缺损，对比观察植人后早期局部组织学改变和炎症因子表达情况，探讨BC的组织相容性及作为硬脑膜替代材料的可行性。 
       材料与方法 
       1.1主要材料和试齐日 细菌纤维素膜“:术醋杆菌恒温静置培养6d后生成的细菌纤维素膜浮于液而取出后，用蒸馏水反复冲洗除去膜表面培养基及杂质;再将膜浸泡于 0.1 mol/f的NaOH溶液，100℃ 0C煮沸20 min，去除液膜中的菌体和残留培养基;然后用蒸馏水多次冲洗，再经冷冻干燥处理后，制备得到细菌纤维素膜，以 727℃高压消毒20 min备用。生物型硬脑(脊)膜补片(人工硬膜);TRIzol试剂(Invitrogen); ReverTraAce-。反转录试齐I]盒(To}obo)。        
       1.2动物和分组 普通级成年新西兰兔24只，雌雄不限，体质量 2 -3 kg，购自上海生旺实验动物养殖有限公司，实验功物生产许可证号码为SCX1<(沪)2012一0007，使用许可证号码为SYXK(沪)2011一0128。动物随机分为A,B两组，每组12只。

       1.3手术和分组处理 动物经2.5%戊巴比妥钠(1 mL/kg)耳缘静脉注射麻醉，俯卧位固定。术前肌肉注射青霉素(80 000 U/只)预防感染、头部剃毛，常规消毒、铺巾头皮正中纵行切口，长约5 cm，分离骨膜，暴露颅骨;去除顶骨、部分额骨及枕骨，形成4 cm x 3 cm胃窗，切除卜矢状窦两侧约2 cm x 1 cm的硬脑膜。A组:以修补右侧硬脑膜缺损，缝线固定;左侧缺损不于修补 (对照)(图l A) B组:以细菌纤维素膜修补右侧硬脑膜缺损，缝线固定;左侧缺损经市售人工硬膜修补 (图IB)严密缝合头皮术后送动物房单笼饲养，白由饮水、进食，每日观察动物活动和伤口愈合情况,1周后拆线。
 

       1.4标本采集 两组动物在设定时间点(A组于术后第30, 90, 180天，B组于术后第7, 14, 21天)采用空气注射法处死按1.3中所述开颅方式再次暴露骨窗，大体观察植人材料与周围组织情况，并切取手术区域组织。 
       1.5组织学检查 取经4%多聚甲醛固定24 h的A组动物手术区域组织标本，石蜡包埋、切片，苏木精一伊红染色 (HF染色)，光学显微镜下病理组织学改变。 1.6 RT-PCR检测 取锡纸包裹后置人液氮保存的B组动物手术区域组织。根据目标基因促炎症细胞因子:肿瘤坏死因子。(tumor necrosis factor-cx , TNF-a )、白介素1日 (interleukin-1(3 , IL-1 (3 )、白介素6 ( interleukin-6 , IL- 6)及内参肌动蛋白((3-actin)的mRNA序列，按照引物设计原则[5]，设计RT-PCR引物序列(表1)，由上海生工生物工程有限公司合成。取100 mg组织加人 1 mLTRIzoI试剂，匀浆器匀浆，抽提总RNA紫外分光光度计测定纯度和浓度。取1ug RNA用ReverTra Ace-a。反转录试剂盒经反转录得到c,DNA;以脑组织 cDNA为模板，用特异性引物扩增待检测的目的基 因TNF-a、1L-6、IL-1(3和卜aclin0 RT-PCR在Tay 反应体系(20浏)中进行:10 x Tay缓冲液，dNTP (10 mmol/L each),DMSO 1.6 L,t,L，正IAJ引物(10 },mol/ I) 0. 5 uL，反向引物(10 umol/L ) 0. 5uL，模板共 1 uL, DNA聚合酶0. 4时,dd H-0补至20时。反应参数:94℃预变性3 min ;94℃变性30 s,58 0C退火 1 min ,72℃延伸1 min，共30个循环。PCP产物进行琼脂糖凝胶电泳，拍照记录。
       2结果

       2.1动物情况 实验动物全部存活，正常饮水、进食，无行为异常和运动障碍。所有动物术后切日愈介良好，尤感染和脑脊液漏发生，均未出现肢体抽搐等癫响症状。 
       2. 2大体观察 术后第30大:细菌纤维素膜与皮下结缔组织及硬脑膜边缘结合不紧密，有少量渗液，与大脑表面无粘连术后第90天:细菌纤维素膜与周围自体正常硬脑膜已互相吻合，用手术器械可钝性分离，修补材料与脑组织无粘连，无渗液术后第180大:细菌纤维素膜及对照侧与周围组织难以区分，通过残留线结可判断修补材料与硬脑膜的吻合部位，修补材料- 表面已被结缔组织完全覆盖。
 

       2.3组织学观察 术后第30 d:细菌纤维素膜平整覆盖于脑组织表面，其外侧面纤维结缔组织明显增生增厚，未见炎哇细胞浸润<图2A);对照侧脑组织表面与疏松结缔组织粘连(图2B)术后第90天:BC表面及内侧面成纤维细胞排列均匀.内部出现弹性纤维，新生血管形成(图2C);对照侧脑组织表面结缔组织厚薄不均，排列紊乱(图2D)。术后第180天:细菌纤维素膜表而被上皮细胞覆盖，可见纤维组织增生，胶原纤维增多内侧面与脑表面无粘连，无中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞反应(图2E);对照侧脑组织与表面结缔组织仍有粘连(图2F)。 
       2.4 IL-1β/ IL-6和 TNF-α mRNA的的表达 术后第7 ,14 ,21天，与人C硬膜修补侧比较.细菌纤维素膜修补侧局部组织IL-1β/ IL-6 mIiNA的表达水平明显较低;细菌纤维素膜修补侧TNF-a m R-V A表达水平在术后第7天时略低于人工硬膜修补侧，术后第14,21天时两侧组织中TNF-a mRN A 表达水平相近(图3)
 

       3讨论
 

       不同原因引起的硬膜缺损，可造成脑脊液漏和颅内感染的发生，导致脑组织与周围组织粘连，易出现癫痫等并发症的发生为保护脑组织，恢复正常的生理解剑结构，必须实施硬膜修补术 临床应用的硬膜修补材料主要有四大类:①自体筋膜:不发生排斥反应、组织相容性佳，但自体膜的提取需另行手术，取材来源有限，且与脑存在一定程度的粘连而易引发癫[7]，很多国家已不使用_ ②同种异体组织(冻干人硬脑膜、:具有正常人休硬膜的超微结构.能够起到一定的支撑和保护脑组织的作用6，但材料来源有限，受到伦理道德限制，目具有潜在感染病毒性疾病的可能，现已禁用。③异种生物材料(牛心包、猪腹膜):组织炎症反应轻微，具有较好的伸展性和弹性，表面光滑，不易与周围组织产生粘连但在加在加工过程中运用的戊二醛会在材料中残留部分醛基，不易清除，阻碍细胞侵人，且具有一定毒性，存在发生异物反应的可能t ①人工合成修补材料( TachoComh-v[9]Vicrvl:取材方便，价格低廉，但作为性异物，排斥反应很难避免.易致无菌性炎症反应，刺激肉芽组织生成、 细菌纤维素是一种在醋酸杆菌发酵培养过程中产生的纤维素，自_径仅为10 --80 nm,属纳米级纤维，具有良好的韧性强度和水合度，有利于组织生长并限制感染，同时细菌纤维素膜在合成时其性能和形状具有可调控性，通过调节培养条件，可得到物理、化学性质有差异的细菌纤维素膜[11]。细菌纤维素敷料对皮肤烧伤有治疗作用[12]，在部分国家已经商品化Sanchez a Oliveira Rd。等[13]对细菌纤维素与人脱细胞真皮基质应川于胎羊脊髓脊膜膨出症的修补 治疗进行丁比较结果显示:细菌纤维素能更充分地覆盖受损神经组织，不私附神经组织的表面及深层，从而减少对脊髓的机械与化学损伤，证实细菌纤维素在术中操作及避免神经组织粘连方面具有优势。
 

       本实验采用新酉兰兔硬脑膜缺损的动物模型对比观察细菌纤维素用于硬膜缺损修补后的病理组织学改变及早期炎症反应。动物情况、大体及组织学观察结果表明:术后动物全部存活.无异常行为及运动障碍;术后伤口愈合良好，无感染及脑脊液漏发生硬脑膜缺损可使头皮下组织直接贴覆于大脑表而形成粘连，而用细菌纤维素修补后，材料与脑组织不发生粘连，早期炎性反应轩微术后第180天时，细菌纤维素与周围白体硬脑膜已难以分辨，其内侧面和外侧面均被纤维结缔组织覆盖，说明细菌纤维素具有良好的组织相容性，且能有效防止头皮与脑组织发生粘连，从而减少脑脊液漏、癫响等并发症的发生 人工材料植人后机体的炎症反应程度是决定应用价值的重要标准。参与炎症反应的细胞因子主要包括TNF-a ,IL-1β/ IL-6等。能促进中 J陛粒细胞吞噬，在炎症过程中对组织损伤和修复具有重要作用 ; IL-1β可介导炎性细胞浸润，加重炎症反应，并可诱导多种神经细胞发生凋亡。IL-6是一种多效性的细胞因子，是许多炎症反应、信号转导和转录的激活剂下本研究应用RT-PC R技术，在术后第7, 14, 21天对局部组织中上述3种炎症因子的表达情况进行了定性检测，结果显示:细菌纤维素膜植人后早期，TNF-a , IL-1β/ IL-6和 TNF-α mRNA的表达均无明显升高，组织炎症反应轻微。进一步证明了细菌纤维索膜具有良好的生物适应性和组织相容性[18].

       参考文献

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