终末期肾病维持性血透患者树突状细胞分化成熟能力的研究

        终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)是各种原因导致肾功能下降，需依靠肾脏朴代治疗(包括血液透析、腹膜透析和肾移植)维持生命的肾脏疾病的统称。有研究表明，随着ESRD患者人数的逐渐增 多，其社会医疗成本已经超越癌症[1]。而感染是目前ESRD患者常见的并发症和死亡原因之一，是仅次于心脑血管疾病的导致透析患者死亡的第二杀手[1]。近年研究提示免疫功能低下可能是导致ESRD 患者感染高发生率的重要原因，但其病理生理及分子机制尚不清楚[2]。众所周知，树突状细胞(dendritic cell , DC)在感染的固有免疫和获得性免疫中发挥关键作用。因此，本研究拟通过体外实验检测ESRD患者DC分化成熟能力及其功能的改变，以期初步阐明 DC与ESRD患者免疫功能低下的关系。
 

       1对象与方法 
       1.1主要试剂和仪器 人淋巴细胞分离液、BPIV'II1640细胞培养液(Biowest, 法国);重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granu- locyte macrophage colony stimulating factor，G l}T一CSF) 和重组人白介素4 (interleakiu-4 , IL-4 ) ( Peprotech，美国);脂多糖(lipopolvsaccharide，LPS)(Sigma一aldrieh，美国);Human IL-12p70 EI.ASA试剂盒( Bender NTedsvstem ,奥地利);抗CD40-FI'I'C抗体、抗CD80- FTTC抗体、抗C C R7 -FITC打L体、抗C D83 -PE抗体、抗 C D86-PE抗体、抗HT.A-DR-PE抗体(eBioscience，美国);低温离心机和FACSCalibur型流式细胞仪(HD, 美国);酶标仪(Thereto，芬兰)。 
       1.2对象和分组
 

       1.2.1 ESRD组随机选取20例在上海交通大学医学院附属第九人民医院肾脏内科一接受门诊维持性血液透析治疗的ESPrD患者，其中男性12例，女性 8例;平均年龄(65. 2士11.4)岁;每周透析2一3次，每次透析)4h，同时子以常规降压药物、促红细胞生成素(ervthropoietin, EPO)、活性维生索D等辅助治疗二、透析治疗前血清肌配平均为(734. 80 1 126. I S ) 林mol/L，透析前血尿素氮平均为(18.%士5. 91 ) mmol/ L.所有研究对象对相关研究知情同意。 1.2.2止常对照组随机选取健康志愿者20名，其中男性10名，女性10名，平均年龄(60.6110.8) 岁依据1TDRD校正公式估算肾小球滤过率(esti- mated glomerular filtration rate，eGFR)>90 mL/(min· 1. 73 m2 )，无长期服用药物史。血清肌醉平均为 (75. 80士10. 33 )林mol/1，血尿素氮平均为(5. 22士 0. 60 ) mmol/L。所有人选对象刘一相关研究知情同意。 入选者对一相关研究知情同意。 1.2.3排除标准自身免疫性疾病和肿瘤性疾病; 乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒等传染性疾病;近 1个月内有严重感染史或长时间使用抗生素治疗;近 6个月内囚各种原因使用激素和(或)免疫抑制剂治疗;近6个月内有活动性出血史或输血史。 
      

        1.3方法

       1.3.1样本采集和处理ESRD组于透析前静脉端采血，正常对照组则采集空腹静脉血，每例取抗凝血 15 m L ;密度梯度离心法分离单个核细胞，经贴壁培养2h去除淋巴细胞，分离出单核细胞，每皿加人 5 mL RPM11640细胞培养液.同时一加人重组人GM- CSF',重组人IL-4各50以，放人细胞培养箱中培养; 培养第3天，子以细胞换液.每皿加入相同剂rt的 RPMI1640细胞培养液、重组人GVl-CSF和重组人 II,-4 ;培养第7天，每皿加人LPS 50ul促进DC分化成熟。 
       1.3.2流式细胞仪检测细胞培养第8天，利用流式细胞仪进行F'ITC , PE双标记荧光检测，每皿细胞标本平均分装人3个流式管，每个流式管分别加人两两配对荧光抗体(抗CD40-F1TC抗体+抗HLA- DR-PE抗体;抗(:D80-FITC抗体十抗CD86-PE抗体; 抗CCR7-FITC抗体十抗CD83-PE抗体)，共6种抗体，每种抗体各5uL，使用Cellquest操作软件进行收取细胞及相关数据分析。        
       1.3.3酶联免疫吸附法(ELASA)检测采用ELAS;4 测定DC培养上清液中细胞因子IL-12水平，严格按照试剂盒说明书的实验步骤进行操作。 
       1.4统计学方法 采用SI'SS 19. 0软件进行统计学分析。计量资料以见士、表示，组间比较采用独立样本t检验， P < 0. 05表明差异有统计一学意义。 
       2结果

       2.1人外周血DC的分离培养 体外培养诱导后观察发现DC形成细胞集落，可见数个DC聚集在一起，呈悬浮状(图1)。从单细胞形态上也可见到部分细胞形成的树突状突起。 
       2.2 DC各表面分子的表达率 采用特异性抗体标记经流式细胞仪对DC各表而分子的表达率进行了检测(图2).统计学分析结 果显示:ESRD组DC表面分子CD40,CD80,CD86, CD83 ,CCR7和HLA-DR的表达率均显著低于正常对照组，组间比较差异均有统计学意义(P < 0. 05和 P<0. O1)(表1)。 
       2.3细胞培养上清液中IL-12水平 ESRD组和正常对照组周血DC培养上清液中细胞因子IL-12的质量浓度分别为(72. 07士3. 03)pg/mL和 ( 23. 97士5. 45 ) pg/mL，组间比较差异具有统计学意义(P<0. 01)。 
       3讨论
 

       DC是目前已知的体内功能强的抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC)，也是目前的体内惟一能激活初始T细胞的APC，能够在缺乏其他任何刺激因子的条件下启动机体的免疫反应[3]。因此，可以说DC是机体免疫应答的始动者，在激活T 细胞介导的免疫应答中具有重要作用。同时，成熟的DC能表达一系列分化抗原，其中与其功能直接有 关的是CDIa、主要组织相容性复合体B类分子 ( major histocompatibility complex II, MHC- II)、人类白细胞抗原DR ( human leukocyte antigen DR, HLA- DR) ,CD80,CD83和CD86等[4]。 
       本研究结果表明:体外培养的ESRD组外周血中的DC表达CD83,HLA-DR,CCR7,CD80,CD86等表面分子的百分比显著低于正常对照组， CD40尤为明显。值得注意的是，国内外的许多同类研究结果之间存在着较大差异。如韩国的相关文献[5]报道， ESRD患者DC表面MHC II ,CD83,CD86,CCR7表达与正常对照并无差异;但根据检测其他因子(如IL-6 等)，其后还是得出接受维持性血液透析治疗的 ESRD患者体内DC的功能存在异常并可能导致其免疫缺陷的结论。其中原因可能既与一些客观因素如人种差异、透析方式不同有关，也可能与实验方法的选择如诱导DC的细胞因子浓度和培养时间的长短等因素相关。 
       国外学者研究发现，CD83是DC的成熟标志[6,7] HLA-DR的不表达或低表达说明DC提呈外源性抗原 能力低下[8];而 CCR7被认为是成熟DC ( mature DC , mDC)迁移归巢，完成抗原递呈从而激活初始T细胞的主要受体之一。结合本次实验结果，我们认为 ESRD患者的外周血单核细胞虽然能与正常人一样在GM-CSF , IL-4和LPS的刺激下分化成DC，但 ESRD患者外周血单核细胞源性的DC发育不成熟，其趋化迁移功能以及外源性抗原递呈能力下降。有学者[9]认为对ESRD患者进行血液透析治疗的过程会加剧其DC的功能丢失。另外，CD40,CD80和 CD86作为DC表面重要的共刺激分子，其表达水平的下降可能直接参与了T细胞的免疫功能缺陷，表现为T细胞活化不充分，不能表现效应功能而呈无能状态，终可能诱导机体特异性的免疫耐受。有文献[10].报道抑制DC表面cDBo和CD86的表达，阻断共刺激通路，可诱导机体特异性的免疫耐受，这一观点与本次实验结果相吻合。在进一步对T细胞亚群的研究中发现，DC细胞表面CD86的表达倾向于刺激1'细胞向Th2转化，CD80的表达倾向于刺激 T细胞向Thl分化[11，12]，尤其是C D40分子对Thl发育非常重要。国外研究指出ESRD患者存在Thl/ Th2细胞失衡，表现Th2优势[13]。本实验中CD4。分子水平的显著降低，或许能很好地推理和解释这一观点。 
       然而在本实验中，似乎出现了一项与上述生理变化过程不符的结果:既然IL-12是活化T细胞表达的CD40L直接诱导DC ( CD40)产生的，那为何在 ESRD组患者C D40分子低表达的情况下反而会出现 IL-12水平的明显升高呢?其中机制尚不明确，我们认为主要是由于以下原因:①ESRD患者的病因各不相同，在我国主要以慢性肾小球肾炎及糖尿病肾病多见，这两种疾病患者体内均存在微炎症状态，本身基础的炎症因子水平就较正常人要高;②ESRD患者体内异常蓄积了各种尿毒症性毒素可能导致全身循环炎性蛋白、致炎症性细胞因子的升高[14];③血液透析过程中所使用的透析液、透析器及体外循环回路材料的生物不相容性可能在与血液接触时激活补体或单核细胞产生细胞因子IL-12[14] ;④由于IL-12的相对分子质量较大，在使用普通低通量透析器进行透析治疗时，直接滤除清除较少;⑤即便从生理学角度分析，IL-12水平本身还受体内其他调控因素影响，与外周血单核细胞来源DC的分泌水平并非呈线性相关。但以上原因只是作为理论推测，尚有待于实验证实。 
       因此，在今后进一步的研究中，可以对上述因素加以控制比较，同时探讨不同透析膜对ESRD患者 DC功能及CD4 T细胞活化及极化的影响。 ESRD患者的DC在其不同生理阶段均存在着功能的缺陷，本研究从Dc的发育成熟、趋化迁移、抗原递呈、免疫激活等角度系统阐明了DC在ESRD患者免疫功能下降中所扮演的角色。研究提示，如果能从调节及千预DC的特异性功能人手，则可能有助于改善ESRD患者的免疫功能，降低感染的发生率，从而提高患者的生存质量和社会回归率，同时也能降低ESRD患者日益增加的医疗费用和负担。 
       参考文献

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