结直肠癌肿瘤干细胞研究进展

         结直肠癌是严重危害人类健康而又常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率和死亡率成明显上升趋势。肿瘤组织中少数具有自我更新能力的细胞能够增殖分化成新的肿瘤细胞，被称为肿瘤干细胞(cancerstemcells,CSC)，是肿瘤形成、耐药、复发和转移的罪魁祸首，结直肠癌干细胞的研究对结直肠癌的诊断、预防及治疗具有重要意义。

         一、肿瘤干细胞
         根据2006年美国癌症协会的定义，肿瘤干细胞指肿瘤内具有自我更新能力和形成异质性肿瘤的细胞亚群。该细胞只占肿瘤细胞的一小部分，却是肿瘤耐药、复发和转移的根源。1994年，Lapidot等对急性粒系白血病细胞的研究证实CSC的存在:占白血病细胞总数0.01%}1.00%的CD34'CD38一肿瘤细胞移植人SLID裸鼠后能诱导形成白血病，而CD34'CD38+和CD34一细胞亚群则不具备该能力。2003年，肿瘤干细胞在实体肿瘤中得到证实，Al-Hajj等[3从乳腺癌组织中分离出CD44'/CD24-/low细胞亚群，并发现该亚群具有肿瘤形成能力。随后肿瘤干细胞先后在肺癌川、卵巢癌’

         一、肝癌[6、胰腺癌川、胶质瘤[8」和结直肠癌叫肿瘤中得到证实。

         二、肿瘤干细胞与结直肠癌的发生
         1.肠道干细胞:肠勃膜表面由单层柱状上皮细胞组成，这些上皮细胞向固有层内陷而形成隐窝。Potten等认为，肠茹膜隐窝基底部是肠道干细胞的细胞库，肠干细胞位于隐窝的基底部，每个隐窝有2-6个肠干细胞，周围的“小生境”(niche)对肠干细胞的增殖和分化起重要作用，肠干细胞向隐窝上部分化迁移，于肠腔表面分化为成熟肠上皮细胞，取代老化脱落的上皮细胞。正常情况下，新形成分化细胞的数量与老化细胞死亡脱落的数量呈平衡状态。

         2.结直肠癌肿瘤干细胞的起源:关于结直肠癌肿瘤干细胞的起源，目前有两种学说，种学说认为，肿瘤干细胞来源于正常肠道干细胞的突变〔tz};第二种学说认为，由肠道分化成熟的细胞转化而来。不过，肿瘤干细胞起源于成体干细胞的突变得到了更多的证据支持。成体干细胞比分化成熟的细胞具有更长的生存周期，更易积累足够的突变从而转化为恶性的肿瘤干细胞。Sell认为，恶性肿瘤的发生发展是由于正常干细胞分化受阻，而不是成熟细胞的去分化。研究发现，结直肠癌的很多基因的突变与肠干细胞相关。Fearon等〔to」发现，APC基因的突变是结直肠癌发生的早期事件，同时可引发隐窝基底干细胞的扩增。结直肠肿瘤干细胞与肠道干细胞具有许多相似之处，如无限增殖自我更新能力和共同的Wnt,Notch及Hedgehog信号调节通路以及端粒酶的高活性和向特定组织分化等.
         三、结直肠癌肿瘤干细胞的标志物
         使用流式细胞技术根据特异性的标志物分离得到CSC，是肿瘤干细胞研究的前提和基础。不过，目前除了血液肿瘤外，在其余实体肿瘤包括结直肠癌干细胞并未找到特异性的标志物，根据常用的CD133,CD44等标志物只能起到“富集”干细胞的作用，分选得到的细胞群体中有相当一部分细胞并不具备成瘤能力。 
        

         1.CD133";CD133作为结直肠癌干细胞标志物早由0'Brien等[9)和Ricci-Vitiani等[15」报道。此后，CD133成为使用为广泛的肿瘤干细胞标志物。0'Brien等[9J从人结直肠癌手术切除标本中分离到1.7%-22.4%的CD133十肿瘤细胞，将CD133十细胞接种于NOD/SCID鼠肾被囊，发现能够重建结直肠肿瘤，而CD133一细胞不具备该能力。Ricci-Vitiani等研究发现，CD133+细胞占肿瘤组织的2.5%左右，不同浓度CD133十细胞皮下接种NOD/SLID裸鼠可成瘤，病理类型与原代肿瘤一致;同时，肿瘤组织中分化出CD133一细胞;CD133十细胞连续传代后肿瘤生长加快，且CD133+细胞数量保持一定比例;而接种105的CD133一细胞不能成瘤在CD133被广泛用作肿瘤标志物的同时，有人提出了质疑。Shmelkov等厂}e7建立了在CD133基因的启动区域转入报告基因lacZ的遗传小鼠模型后发现，CD133广泛表达于成年小鼠结肠上皮细胞;用CD133抗体免疫组化检测正常人体结肠上皮，显示CD133蛋白表达于绝大多数分化成熟的肠上皮细胞;同时发现，从结肠癌肝转移组织中分离得到的CD133一细胞具有比CD133+细胞更强的成瘤能力.EpCAM/CD44/CD166;Dalerb。等[n从6例结肠癌组织中分离得到EpCAMhigh/CD44·和EpCAMIow/CD44一细胞，注射于NOD/SLID裸鼠，发现200一500个EpCAMhigh/CD44‘细胞可成瘤，而10'个EpC.AMlow/CD44一细胞不能成瘤。他们应用系统评价的方法发现，EpCANIhigh/CD44'群体基本包含在CD133+细胞群体之内，也许使用EpCAM/CD44比单独使用CD133能更进一步富集肿瘤干细胞。此外，他们提出CD166可作为一种联合的标志物富集肿瘤干细胞。 
         3.CD133/CD44;Haraguchi等提出，CD133联合CD44能更好地富集肿瘤干细胞，他们将结直肠癌分选为3个亚群:CD133*/CD44',CD133'/CD44一和CD133-CD44-，皮下注射于NOD/SLID裸鼠，发现只有CD133`/CD44十具备成瘤能力。Chen等「I9」发现，103的CD133'/CD44‘细胞能使NOD/SLID裸鼠致瘤，而10，非CD133"/CD44+细胞无法成瘤。体内外实验证实，CD133}/CD44+细胞具有更强的转移能力，并高表达上皮间质转化标志物，可能是肿瘤细胞发生远处转移的特定细胞亚群。 
         4醛脱氢酶1(aldehydedehydrogenase1，ALDH1):ALDH1被证实能维持干细胞的存活，近来被认为是一个有前景的CSC标志。Huang等}w;对7例结直肠癌的研究显示，ALDH1'EpCAM十细胞范围在(3.5士1.0)%,500个ALDH1EpCAM+细胞皮下注射于NOD/SLID裸鼠能形成肿瘤，而105的ALDH1-EpCAM十细胞不能形成肿瘤。该研究提示，ALDH1是结肠CSC的一个标志，结合CD133可以增加CSC的富集。 四、肿瘤干细胞的信号转导通路调控肠道干细胞和肿瘤干细胞有着相似的信号通路调控机制，由于肠道干细胞通路调控紊乱导致恶性转变，成为肿瘤干细胞的重要发生机制。肿瘤干细胞信号通路的研究不仅有助于肿瘤发生机制的阐明，对于通路关键靶点的干预亦能够成为消灭肿瘤干细胞的有效策略。 1.Wnt通路:结直肠癌组织检测通常发现Wnt通路的异常激活，APC基因的失活突变往往是肿瘤形成的起始事件’气同时研究发现，Wnt通路同样是维持干细胞干性的关键通路0。Kanwar等发现，Wnt通路在结直肠癌十细胞中被异常活化，利用RNA干扰技术阻断一catenin，发现肿瘤细胞成球能力减弱，CD44*细胞数量减少，表明Wnt通路在结直肠癌肿瘤干细胞的维持中起重要作用2.Notch通路:Notch通路同样是维持干细胞的一条重要通路。Fre等m一激活肠道上皮细胞的Notch通路，结果发现了肠道分化上皮细胞的减少和干性细胞的增多。Sikandar等za}利用成球培养法富集肿瘤干细胞，发现Notch通路活化比普通肿瘤细胞高出10--30倍，利用RNA干扰技术，发现Notch通路可以通过P27和}TOH1抑制肿瘤干细胞的凋亡，并抑制分化基因}ICC2从而维持其干性3.Hedgehog通路:多项研究证实，Hedgehog信号通路在多发骨髓瘤、乳腺癌和恶性胶质瘤的干细胞中高表达，并在肿瘤干细胞自我更新中起重要作用〔zs-zpLiu等f}7激活乳腺癌干细胞的Hedgehog通路可以刺激肿瘤细胞成球培养，提高肿瘤干细胞的数量，这一过程可以被SMOH的抑制剂环巴明(cyclopamine)阻断，证明Hedgehog通路通过Bmi-1参与乳腺癌干细胞的自我更新和维持。Varnat等aft敲除Hedgehog信号可导致结直肠癌干细胞数量明显减少体外干细胞培养条件下几乎不能形成球样细胞。相反，激活Hedgehog信号则使直肠癌干细胞数量明显增加。

         五、研究意义和治疗策略
         在传统的治疗方式下，肿瘤干细胞具有更强的生存优势，化疗和放疗无法完全杀灭肿瘤干细胞，成为肿瘤复发和转移的根源。在传统治疗方式的同时，如果能联合使用有效杀灭肿瘤干细胞的治疗策略，可终达到真正治愈肿瘤的目的。针对肿瘤干细胞生物学特性，研究者们开展了一系列治疗设想和尝试。

         1.以细胞表面标志物为靶点:肿瘤干细胞表面的特异性标志物可以成为杀灭细胞的有效靶点。急性髓性白血病以不成熟髓细胞在骨髓里聚集及骨髓造血抑制为特征，骨髓髓样干细胞分化成熟障碍，停止在早期髓性分化阶段。而肿瘤干细胞标志物CD44在促进髓性分化中起重要作用「z9-3o}。因此，可以利用CD44激活性抗体促进髓样干细胞分化。Charrad等[[3l〕在体外实验中利用CD44抗体有效逆转髓样干细胞分化阻滞.并促进肿瘤干细胞的凋亡。Jin等将白血病干细胞移植进小鼠体内，并注射CD44激活性抗体H90，发现能有效抑制I,SCs的迁移和增生。提示，CD44可能成为杀灭肿瘤干细胞的有效靶点。不过，由于该标志物缺乏特异性，在杀灭肿瘤十细胞的同时如何避免影响正常组织细胞，是人们需要关注的重要问题。

         2.阻断肿瘤干细胞的维持通路:肿瘤于细胞通路的研究不仅有助于肿瘤发生机制的阐明，对通路关键分子的干预也是肿瘤干细胞靶向治疗的重要策略。Lin等s;发现，STAT3通路在肠癌细胞系的ALDH'/CD133十细胞过度活化，维持肿瘤于细胞的自我更新和十性，给予STAT3抑制剂FLLL32,能有效减少细胞系中ALDH'/CD133一细胞数量以及细胞成球能力。Kanwar等翌发现，通路在结直肠癌干细胞中活化，siRNA干扰一catenin的表达则导致肿瘤干细胞数量的减少。Sikandar等，利用Notch通路关键分子yJecretase的抑制剂D_4PT处理结直肠癌干细胞，发现Notch通路被抑制的同时，肿瘤于细胞数量下降了50%，在体外3D培养中发现干细胞分化为上皮和杯状细胞说明肿瘤干细胞异常活化的通路抑制剂可以作为一种杀灭肿瘤十细胞的有效策略。

         3.增强肿瘤干细胞的化疗敏感性:化疗对于增殖活跃的肿瘤细胞有较好的杀灭效果，不过无法完全清除增殖井不活跃的肿瘤干细胞，成为肿瘤复发的重要原因Todar。等“发现，上调的白介素4(IL-4)是CD133一结直肠癌下细胞避免凋亡的重要细9}?因子在体外给予氟尿咭咤c5_I_I和奥沙利今Q;}W钟瘤时发现.对CD133一拙组有段好刃杀灭致果.而CD13一细袍能日分泌。

         4.增强井有十川范目之厅振}.i通过体外给予I1.-4抗体.发现}-FC和奥少利FLJj-n:0133-细咆的杀灭效果明显增强，给NOD/SCID裸鼠神瘤漠型中注衬IL-4抗体发现，比单用化疗药有更强的肿有抑制作用，并显著减少肿瘤组织中CD133+细胞的数量Loml,ard。等;

         5研究表明，促进肠道干细胞分化的成骨蛋白4(BMP4)亦能促进结直肠癌肿瘤干细胞的分化和凋亡，并通过PI3K/f1KT通路增加CSC对化疗的敏感性叹、结直肠癌干细胞研究面临的问题和思考肿瘤十细胞研究目前还处于起步阶段，面临较多的问题和挑战寻找到种瘤干细胞表面标志物是研究的基础和关键。不过，各种肿瘤J二细饱的特异性标志物一自以来都有较大的争议。鉴定肿瘤细胞是否为C:二金标佳”为移植成瘤实验，根据细胞表面标志物分选细胞能够重建肿瘤的细,;则被认为是肿瘤干细胞，不过这种检测标准同样存在较多争议首先.;.于种蔺差异性，肿瘤异种移植裸鼠并不能完全代表人体内的生长环境能够在裸鼠体内致瘤的细胞亚群也许只是能够在异种环境中有生存优势的细胞群体，而并不能礁定是(:SC;其次，在种瘤组织处理以及细胞分选的过程中，细报刃三存活力和表面标志物可能有所改变，引起了致瘤能力G坟夏:薄次，目前广泛用于CSC研究的NOD/SCID鼠体内仍维持有目然杀伤细胞的活性，而(}uintana等提出OD/SLID-1L2Pry裸鼠是一种比NOD/SC工D鼠更佳的肿瘤干细胞研究模型，体内B细胞、T细胞和自然杀伤细胞缺失，有更强的肿瘤异种移植致瘤性。 对于肿瘤干细胞的治疗，目前仍处于基础研究阶段，各种治疗策略构想共同面临的问题是如何特异性识别肿瘤干细胞而对正常组织细胞无害。由于特异性的肿瘤干细胞表面标志物并未发现，目前提出的治疗方案对人体存在较大的风险。比如Hirsch等37}提出的通过靶向杀伤CD133'细胞以达到消灭肿瘤干细胞的目的。但是，Shmelkov等oe研究表明，CD133在人体正常肠道上皮细胞同样广泛表达，以CD133为细胞靶点治疗肿瘤，明显会对正常组织造成伤害。

         七、展望 肿瘤十细胞是当今肿瘤研究中的热点问题，尤其是CSC的靶向治疗能够克服传统化疗和放疗的盲目性，减少肿瘤的复发、耐药和转移。不过，由于目前实验方法技术的限制，CSC以及特异性标志物存在较大争议。如何建立可靠的动物模型、如何找到具有特异性的表面标志物和如何选择性杀伤CSC而不损伤正常细胞，这些问题应该成为今后研究和努力的方向，从而进一步推动肿瘤的诊断、预防和治疗.为肿瘤患者带来福音。

         参考文献 
         Clarke MF,Dick JE,Dirks PB. Cancer stem cells—perspectives on current status and future directions:AACR Workshop on cancer stem cells[J].Cancer Research,2006.9339-9344.
         Lapidot T,Sirard C,Vormoor J. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice[J].Nature,1994.645-648.
         A1-Hajj M,Wicha MS,Benito-Hernandez A. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2003,(7):3983-3988.doi:10.1073/pnas.0530291100.
         Eramo A,Lotti F,Sette G. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population[J].Cell Death & Differentiation,2008.504-514.
         Curley MD,Therrien VA,Cummings CL. CD133 ex[x]pression defines a tumor initiating cell population in primary human ovarian cancer[J].Stem Cells,2009,(12):2875-2883.
         Yang ZF,Ho DW,Ng MN. Significance of CD90+ Cancer Stem Cells in Human Liver Cancer[J].Cancer Cell,2008,(2):153-166.doi:10.1016/j.ccr.2008.01.013.
         Collins AT,Berry PA,Hyde C. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells[J].Cancer Research,2005.10946-10951.