血浆miR-206在结直肠癌中的表达及意义

　　局部微环境缺氧是结肠癌进程中比较明显的现象。活体内芳香烃受体核转运子(ARNT)是许多碱性螺旋一环一螺旋(bHLH)-PAS蛋白共同的专性二聚化配偶体，其中芳香烃受体(AhR)、缺氧诱导因子(HIF)-1a,2a和3a等均需一jARNT亚基结合后才能参与机体内许多与缺氧有关的重要的生物学过程断。 　　

　　我们通过筛选出有效沉默人结肠癌HT29细胞ARNT基因表达的小干扰RNA(siRNA)，建立稳定沉默ARNT基因的HT29细胞株。 　　

　　材料与方法 　　

　　1.材料:干扰序列dsDNAoligo，购自上海吉凯基因技术有限公司;T4DNAIigase,AgeI和EcoRI，购自NEB公司;QiagenPlasmid大抽试剂盒，购自Qiagen公司，阳性克隆测序由美季生物公司完成;脂质体转染试剂盒Lipofectamine2000，购自Invitrogen公司;Taq聚合酶、RNAisoPlus,Primesc[x]ript)RTreagent试剂盒和SYBR.PremixExTaqT}t，购自TaKaRa公司;DMEM和RPMI1640培养液、胎牛血清，购自Gibc。公司;RIPA裂解液、二喳琳甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒和阶肌动蛋白抗体，购自Beyotime公司;WesterningPlus一增强化学发光(ECL)，购自Piers二公司;、R\丁抗体，购自Proteintech公司。‘漫病毒载体(LV)系纽刃上海吉凯公司产品，由目的慢病毒载体GV115(元性五序:huh-MCS-CMV-EGPP),pHelper1.0载体和}}Helper2.0载体3质粒组成。HT29结肠癌细胞株购自上海拜力生物公司(第3代);包装慢病毒细胞株293T细胞购自中国科学院细胞库;大肠杆菌菌株DHS。购于上海超研生物利一技有限公司。 　　

　　2.构建表达ARNT短发卡RNA(shRNA)的慢病毒载体并测序鉴定:针对目的基因序列(GeneID;405)，利用公用网站中提供的RNA十扰序列设计原则，设计多个RNA干扰靶点序列，根据设计软件进行评估测定，选择佳的动力学参数靶点，确定有效干扰ARNT基因的靶点序列:5'-TTGTCCAGAGGGCTATT}A-3',命名为LV-ARNT-RNAi一1;5’-CTACACTCTCC.AACACAA1'-3’，命名为LV-ARNT-RNAi-2;5'-GAAGTCAGATGGTT-I一}Pl'T_3'，命名为LV-ARNT-R11}Ai-3;5'-CCTGA"工-}_}TI:GTTCAAGTT-3'，命名为LV-ARNT-RNAi-}:用Fi\}干扰实验中的RNAi阴性对照(NC)}cramhle序几「5’-T"fCTCCGAACGTG'1'C_ACGT-3')作为阴性对井.扮名为LV-ARNT-RNAi-n。设计并分t}」合成其}:nPWA的单链DNAOligo(内含AyeI和EcuRI酶切位点)经退火形成双链DNA，通过T4DNA连接酶与4geI和EcaRI酶切后的GV115载体连接，转化大肠杆菌DHSa，挑取转化子，使用GV115通用引物进行聚合酶链反应(PGR)，将PGR阳性克隆行测序鉴定。 　　

　　3.慢病毒包装:提取慢病毒包装系统中3种质粒D\A转染前24h，取对数生长期的293T细胞，调整细胞密度为6x108/L，接种于15cm细胞培养皿内-h待细胞密度达70%一80%时，按Lipofectamine-i1r)0说明书进行转染。收集转染后48h的293T细胞上青夜，离心浓缩后一80℃保存。 　　

　　4.慢病毒滴度测定:转染前1d,293T细胞按4x108/L,100闪每孔接种于96孔板。实验当天，根据病毒的预期滴度，对待测定的病毒原液进行7次10倍梯度稀释。第1次10倍稀释，所得病毒原液为第1个Ep管中的1/10，病毒原液量记为1E+0闪;第7次10倍稀释，病毒原液量记为1E-6闪。转染4d后，在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达，病毒滴度=带有荧光的细胞数/病毒原液量，单位为TU/ml。 　　

　　5.重组慢病毒转染HT29细胞效率检测:分别以感染复数(MO1)=150,100,50,25,15和10的LV-ARNT-RNAi-nc慢病毒转染HT29细胞。培养72h后制备细胞悬液，流式细胞仪检测转染效率。后续实验均采用佳MOI}
　　6.重组慢病毒转染HT29细胞及分组:细胞分为空白对照、LV-ARNT-RNAi-nc;,LV-ARNT-RNAi-1,LV-ARNT-RNAi-2、LV-ARNT-RNAi-3和LV-ARNT-RNAi6组。转染前1d将HT29细胞接种至6孔板中，1x105个/孔，使转染时细胞融合达到30%一40%。转染时，MOI-100，病毒感染的同时加人工作液浓度为5群L的聚凝胺。72h后倒置荧光显微镜下观察、拍照。将慢病毒感染成功的细胞通过有限稀释法接种于96孔板，待形成境界清楚的克隆，挑取有荧光的单克隆至24孔板中，扩大培养。 　　

　　7.验证内源靶点:用来构建慢病毒载体的表达质粒GV115载体，带有GFP。提取RNA或蛋白前，每个样本随机选择3个观察点拍照(放大200倍)，通过阴阳对比图，粗略计数带荧光细胞占总细胞比例。 　　

　　8.引物有效性鉴定:配置1%琼脂糖凝胶制板，将电泳样品依次点人加样孔中，将制胶板放人电泳槽中，加人电泳液1xT-1E,士J一少干电泳仪，电压100V,30minx电泳结束，嗅化乙锭溶液中染色巧min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，照相记录。 　　
　　9.2as法计算基因相对表达量的有效性验证:按加人('DNA模板起始量分为0.1,0.5,1.0,2.。闪共4组，每组6个复孔，其中一半复孔加ARNT引物，另一半加人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)引物，进行实时荧光定量PCR(FQ-PCR)，重复3次。计算出ARN'1和GAPDH的△CT值，通过cDNA浓度梯度的log值对△C1'值作图，得直线相关系数r},假设检验Ho:P-0，即c}DN;A模板浓度与△CT值之间无线性相关关系，H,}p}0,即cDNA模板浓度与△CT值之间有线性相关(a=0.O5)如果所得a>0.05，说明目的基因和内标基因扩增效率相同，可以通过2-vvct法进行相对定量。 　　

　　10.PCR检测HT29细胞ARNTmRNA表达水平:提取细胞总RNA后，检测其吸光度(Azeo}Azso)值，逆转录成cDNAARNT正义链5'-TCATCTCCCGACA-CAACATT-3’和反义链5'-AAGCTGCTGGTCTTCAG-GAT-3',扩一增产物大小为134帅;人GAPDH正义链5'-GTCGGTGTGAACGGAT'IT-3’和反义链5'-ACTC-CACGACGTACTCAGC-3'，扩增产物大小为276by。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。按SYBR.
　　PremixExTaq试剂盒说明进行PCR扩增，每组设立3个复孔，反应程序:预变性95℃30s;PCR反应950C30s,600C34's,40个循环。用溶解曲线确定产物特异性。以G.APDH为内参照，以2一“ACl法计算基因相对表达量,mRNA的相对变化量公式为:干扰效率=1-2一“}c}。实验结果为3次独立重复实验。 　　

　　11.westernblot检测ARNT蛋白表达水平:收集细胞，抽提蛋白，进行十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳。电泳结束后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。 　　

　　封闭后，加人ARNT抗体和兔抗p-actin多克隆抗体(1:1800)，置于4℃杂交过夜。次日，加辣根过氧化物酶标记二抗(1:2000)，室温反应1h。检测杂交信号。测量显影片的灰度值，以卜actin基因作为内参进行数据标准化，以空白对照组做为参照样本，计算其余各组蛋白的相对水平。实验重复3次。 　　

　　12.统计学方法:应用SPSS13.0统计软件分析，数据以均数士标准差(x士、)表示，采用One'ayANOVA检验。 　　

　　结果
　　1.阳性克隆的测序鉴定:测序结果表明合成的ARNT-shRNA核昔酸序列插人正确，无碱基缺失和替换。对测序结果正确的克隆进行质粒提取，测重组慢病毒质粒DNA,上}o/Aza。值为1.8一1.9，说明质粒DNA的纯度和完整性很高)。 　　

　　2.重组慢病毒的滴度:提取获得的慢病毒液滴度为LV-ARNT-RNAi一1、1.OE+9TU/ml，LV一ARNT-RNAi-2,6.OE+8TU/ml，LV-}4RNT-RNAi-3、6.OE+8TU/ml，LV-ARNT-RNAi-},8.OE+8TU/ml，LV-ARNT-RNAi-nc}1.OE+9TU/ml。说明有大量质粒转人293T细胞，病毒包装成功。 　　
　　

　　3.佳MOI的获取:MOI-0,10,15,25,50,100和150时，转染效率依次为0,25.82%,35.90%,53.50%,64.59%,75.90%,78.50%。随着MOI的递增，转染效率增加明显减慢，考虑慢病毒用量，确定MOI=100为佳转染条件。 　　

　　4.内源靶点验证:在荧光显微镜下观察5组克隆筛选获取的转染慢病毒细胞株，可以观察到发出绿色荧光的细胞比例大于90%，认为感染效率达到要求，可以收集细胞提取总RNA和总蛋自进入后续筛选实验。 　　

　　5.引物检测结果:电泳结果显示产物分子大小和理论值一致，未见非特异性条带，说明引物有效(图1)。 　　

　　6.(a法计算基因相对表达量的有效性验证结果::=0.0451，根据检验统计量t值公式，所得t值为0.0638,v二z，查t界值表，得。大于0.05，接受Ho，说明目的基因和内标基因打一增效率相同，可用2-}oc}法进行相对定量。 　　

　　7.PCR检测结果:LV-ARNT-RNAi-3重组慢病毒转染人HT29结肠癌细胞后对ARNTmRNA表达敲减效率达70%左右(表1)。扩增曲线和熔解曲线分析表明对ARNT和GAPDH基因进行了有效而准确的扩增。I}unnett'sT3法:LV-ARNT-RNAi-nc和阴性对照组之间差异无统计学意义(P>0.05),LV-ARNT-RNAi-l,LV-ARNT-RNAi-2和LV-ARNT-RNAi}组分别与LV-ARNT-RNAi-nc组之间差异均无统计学意义(P>0.05),LV-ARNT-RNAi-3分别与LV-ARNT-RNAi-nc和阴性对照组之间差异均有统计学意义‘P<0.05)。 　　

　　8.LV-ARNT-RNAi-3下调HT29细胞的ARNT蛋白表达水平:Westernblot结果显示LV-ARNT-RNAi-3组的ARNT蛋白表达量明显低于其他各组，蛋白相对表达水平下降达60%(表2，图2)oLSD法:LV-ARNT-RNAi-1,LV-ARNT-RNAi}nc分别与阴性对照组之间差异均无统计学意义(P>0.O5),LV-AR\T-RNAi-3分别与LV-ARNT-RNAi-nc和阴性对照组之间差异均有统计学意义(P<0.O5)。 　　

　　讨论
　　目前常用的RNA干扰载体中，转染慢病毒载体是实现长期RNA干扰并获取稳定转染细胞株的佳方法。本实验对人ARNT基因编码区设计并合成了4对shRNA,测序结果表明成功构建了ARNT-shRNA慢病毒表达载体。合成的5组重组慢病毒滴度在6x10}-1x109TU/ml之间。木实验结果显示，靶点不同，沉默效果不同，这说明慢病毒介导的RNA干扰效率与所选择的干扰靶点有关。在慢病毒介导RNA干扰No}o受体基因治疗脊髓损伤的实验研究中，目的基因沉默效率达到60%左右时，可以对细胞的生物学特性产生影响。我们设计的LV-ARNT-RNAi-3重组慢病毒明显下调ARNT的mRNA和蛋白的表达，基因沉默效率达60%以上，为探讨ARNT基因对结肠癌的生物特性影响奠定实验基础。 　　

　　参考文献 　　

　　He L,Hannon GJ. MiRNA:small RNAs with a big role in gene regulation[J].Nature Reviews Genetics,2004.522-531.
　　Mitchell PS,Parkin RK,Kroh EM. Circulating miRNA as stable blood-ba[x]sed markers for cancer detection[J].Proceedings of the National Academy of Sciences(USA),2008.10513-10518.
　　龚文容,卢晓明,陈志松. miR-145在结直肠癌组织的表达及临床意义[J].中华实验外科杂志,2011,(1):35-36.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2011.01.011.
　　张鹏,周总光,王玲. 直肠癌组织中miR-155和miR-200c的表达差异及意义[J].中华实验外科杂志,2010,(1):59-61.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2010.01.025.
　　曾俊杰,孙凯,吴承堂. 结直肠癌与毗邻癌旁组织中microR-NA-221与CDKN1 C/p57的差异表达[J].中华实验外科杂志,2011,(1):19-21.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2011.01.005.
　　于振涛,蔡星,尚晓滨. microRNA在结肠癌组织的表达及其临床意义[J].中华实验外科杂志,2008,(7):894-896.doi:10.3321/j.issn:1001-9030.2008.07.029.
　　Varkonyi-Gasie E,Hellens RP. Quantitative stem-loop RT-PCR for detection of miRNA[J].Methods in Molecular Biology,2011.145-157.
　　Hurley J,Roberts D,Bond A. Stem-loop RT-qPCR for microRNA ex[x]pression profiling[J].Methods in Molecular Biology,2012.33-52.
　　Ng EK,Chong WW,Jin H. Differential ex[x]pression of miRNA in plasma of patients with colorectal cancer:a potential marker for colorectal cancer screening[J].Gut,2009.1375-1381.
　　Cheng H,Zhang L,Cogdell DE. Circulating plasma MiR-141 is a novel biomarker for me[x]tastatic colon cancer and predicts poor prognosis[J].PLoS One,2011.e17745.