慢病毒介导LIGHT基因在结直肠癌细胞HCT116中的表达

         成熟微小RNA(miRNA)是真雄生物中一类高度保守的小片段非编码的RNA，参与细胞的增殖、分化等基本活动。研究结果显示miRNA可以充当抑癌基因和原癌基因作用，参与多种肿瘤的形成和发展。近研究显示，循环血中存在miRNA，并且这些miRNA不易被RNase降解，肿瘤起源的miRNA与正常比较存在差异，因此有望作为肿瘤标志物指导临床实践。在结直肠癌组织标本中已经发现多种miRNA表达异常，并且这些miRNA与肿瘤细胞的生物学行为密切相关，具有潜在的辅助诊断和预后评估的意义。目前国内关于结直肠癌血浆差异miRNA的研究报道尚少。我们采用聚合酶链反应(PCR)阵列法筛选结直肠癌血浆中差异表达的miRNA，应用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)技术进行验证，并探讨其在结直肠癌中的价值。 　　
         材料与方法 　　
         1一般资料:收集首都医科大学附属北京世纪坛医院消化内科2009年1月至2012年5月收治的36例结直肠癌患者外周血，标本获得前患者未经任何手术及放化疗治疗，无合并症，患者均经病理检查确诊，无其他肿瘤病史，其中男21例，女15例;年龄42一86岁，平均年龄67岁;腺癌32例，戮液腺癌4例，神经内分泌癌1例;按照美国癌症联合会(AJCC)第六版标准进行TNM分期，其中fl期14例，111期19例，W期3例;另外，收集同期在首都医科大学附属北京世纪坛医院门诊26例健康体检者外周血，均证实无肿瘤病史，其中男性11例，女性15例;年龄48一77岁，平均年龄64岁，结直肠癌患者和健康体检者年龄和性别匹配(P>0.05),所有标本的采集均获得本人的知情同意。 　　
         2.方法:(1)血浆样本的收集:收集待检者2ml外周血迅速转人乙二胺四乙酸(EDTA)采血管中，在室温下静置15一30min,4℃1760xg离心10min，小心吸取上清到洁净的1.5m1离心管中，一80℃冰箱中保存(2)血浆中总RNA的提取:取上述血浆样本400p,l，按小RNA提取(mirVanamiRNAIsolation，美国AppliedBiosystem公司)试剂盒方法抽提总RNA，取1p,lRNA，在NanoDropND一1000Spectrophotometer仪(美国NanoDrop公司产品)测定浓度，-80℃冰箱中保存。(3)TaqMan.PCR阵列方法检测血浆样本中miRNA的表达:随机选取7例结直肠癌患者血浆RNA(TNM分期:11期3例、l期3例、W期1例;腺癌6例、黍占液腺癌1例)及6例健康体检者血浆RNA3闪，根据小RNA逆转录引物库(MegaplexHumanPool，美国AppliedBiosystem公司)配置反应体系，反应条件:16℃2min,42℃1min,500C1s循环40次;85℃5min。因血浆中RNA峰度值低，因此将产物预扩增。 　　
        

          取2.5闪逆转录产物，按照预扩增混合物(TaqManPreAmpMasterMix，美国AppliedBiosystem公司)说明书配置体系，反应条件:95℃预热10min;55℃2min;72℃2min;95℃15s,60℃4min循环12次;99.90C10min。产物用75p,10.1xTEpH8.0稀释，一200C保存。按照实时荧光定量PCR混合物(TaqManUniversalPCRMasterMix,NoAmpEraseUNG，美国AppliedBiosystem公司)说明配制体系，取100p,1上样于PCR阵列上(TaqMan.HumanMicroRNAArray，美国AppliedBiosystem公司),314xg离心1min2次，用Real-timePCRAB7900HT反应，条件为:94.5℃10min;97℃30s,59.7℃1min循环40次。反应结束由计算机自动计算各反应管内的Ct值。(4)Real-timePCR验证TaqMan}PCR阵列检测结果:分别取29例结直肠癌患者血浆总RNA和20例健康体检者血_浆总RNA5闪，根据小RNA逆转录试剂盒(TaqManMicroRNAReverseTransc[x]ription，美国AppliedBiosystem公司)逆转录试剂盒合成cDNA，反应条件:160C30min,420C30min,850C5min。取2.5p,1逆转录产物，按照TaqMan.PreAmpMasterMix(美国AppliedBiosystem公司)说明书进行预扩增。产物加人75闪O.1xTEpH8.0稀释。以eDNA为模板，应用TaqManUniversalPCRMasterMix试剂盒(美国AppliedBiosys-tem公司)在Real-timePCRAB7500仪上进行Real-timePCR反应，以U6小核RNA为内参，引物的序列依据http;//www.mirba[x]se.org(表1)，由上海英杰公司合成，用稀释的产物1闪，引物1闪，配成20闪的反应体系，反应条件:950C10min,950C15s,60℃60s,40个循环。每个靶点重复3次反应结束由计算机自动计算各反应管内的Ct值.
　　3.统计一学方法:MicroRNA表达水平采用相对定量方法，即计算OCt=CtR}、一CtL6来表示相对表达量，计算D}Ct=OCt}病例组;一OCt。对照绷，以2一“蜘表示每个miRNA的变化倍数，再将结果转化为1og10的对数形式。利用多重比较检验分析TaqMan.MicroRNAArray结果，建立随机方差模型(RVM)，借助分析工具为TwoClassDif，对两组进行比较，计算MicroRNA间差异的显著性水平(P值)和误判率(FDR)，得到差异有统计学意义的MicroRNA;应用SPSS16.0软件对Real-timePCR检测结果进行分析，数据表示方法为均数士标准差表示;组间比较采用t检验;聚类分析采用Cluster3.0软件进行;通过logistic回归分析寻找佳血浆中miRNA的组合。 　　

           结果
　　1.TaqMan.PCR阵列检测血浆中miRNA的表达:根据7例结直肠癌患者和6例健康体检者TaqMan MicroRNAArray检测结果绘制箱式图发现患者6信号值范围与其他样本差异大，将其剔除。在P<0.05,FDR<0.05的条件下共筛选出42个结直肠癌特异性血浆差异miRNA，其中20个miRNA在患者血浆中表达增高，22个miRNA在患者血浆中表达降低。利用Cluster3.0软件对42个差异miRNA进行聚类分析，其中6例患者和5例健康人能够被正确的分开，正确划分率分别为85.7%和83.3%。进一步提高筛选条件，在Foldchange>1.0，且P<0.05条件下共筛选出16个结直肠癌特异性血浆miRN.9，进行验证研究。见表2。 　　

         2.Real-timePCR验证TaqMan.PCR阵列检测结果:检测结果见表3,2个miRNA在患者血浆中表达增高，14个miRNA在患者血浆中表达降低。其中miR-125b,miR-375、miR-150、miR-206与TaqVIan⑧MicroRNAArray检测结果一致，表达均降低，且与健康体检者比较差异有统计学意义(P<0.OS);miR-126#,miR-378,miR}183-Sp,miR-520c-3p虽与健康体检者比较差异有统计学意义(P<0.05)，但表达水平与TaqMan.MicroRNAArray检测结果不符;miR-342-3p,miR-127,let-7b,miR}09-3p表达水平与TaqManMicroRNAArray检测结果相符，但与健康体检者比较差异无统计学意义((P>0.OS)。miR-126,miR-24,miR-146a,miR-7d表达水平与TaqMan.MicroRNAArray检测结果不符，并与健康体检者比较差异无统计学意义(P>0.05)。在后续分析中排除miR-126#,miR-378,miR-483-Sp,miR-520c-3p,miR-342-3p,miR-127、let-7b、miR}09-3p}miR-126、miR-24,miR-146a,let-7dologistic回归寻找佳microRNA组合时发现只有miR-206进人到回归模型中，表明miR-206表达水平对区分结直肠癌患者与健康体检者意义更大，即在其他因素不变的条件下，miR-206每增加1个单位，发生结直肠肿瘤风险增加为原来的0.29倍[比值比(OR)=0.29,95%可信区间(CI);0.12一0.67];根据每个样本的TNM分期进行统计学分析发现，miR-206在结直肠癌的早期就会出现明显的表达下降，与健康志愿者比较差异有统计学意义(P<0.05)。 　　

         讨论
　　miRNA在结直肠癌中的研究大多应用组织标本，曾俊杰等`5〕研究表明miR-221在转录后水平调节细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子，从而促进结直肠癌的发生发展，而于振涛等困研究表明组织表达异常的miRNA可以用作结直肠癌的早期诊断。近几年，由于检测技术的发展〔78〕，可以将这些含量少的血浆miRNA应用快速、特异、高通量的手段检测出来。Ng等L9〕早在患者血浆中发现miR-17a-3p和miR-92a在结直肠癌患者血浆中高表达，术后7d表达水平下降。Cheng等「‘“」研究表明miR-141与肿瘤的TNM分期有关，是转移性结肠癌的独立预后因素。之后，越来越多的研究结果显示循环血miRNA对肿瘤早期诊断、分期、预后评估等方面具有重要的提示作用这些结果均提示循环miRNA作为一种非侵人性的诊断和预后评价的肿瘤标志物具有很好的应用前景。本研究通过PCR阵列法初步筛选并用Real-timePCR进行验证，终发现与健康人比较，miR-125b,miR-375,miR-150,miR-206在结直肠肿瘤患者血浆中表达水平差异有统计学意义。同时发现，miR-206对区分结直肠癌患者与健康体检者意义更大，在结直肠癌患者血浆中表达降低，并且肿瘤早期就出现明显的下降。在已报道的文献中，Vickers等一‘“es研究结直肠癌组织标本中发现miR-206在肿瘤组织中表达减低，5种miRNA(miR-21,135a,335,206,let-7a)联合评价结直肠癌出现远处转移的敏感性是76}/o，特异性是87plc，有望作为预后评估的指标。在其他肿瘤中也发现miR-206的作用。fang等在非小细胞肺癌组织发现miR-206在肿瘤组织和细胞株中表达降低，并且与肿瘤细胞的侵袭能力呈负相关。在另一项喉鳞状细胞癌组织和细胞中发现miR-206通过调节血管内皮生长因子发挥抑癌基因的作用一，6〕。 　　

         在肿瘤患者体液中研究miR-206的表达目前报道不多，有报道指出组织和血浆或血清中miRNA表达常存在不一致的地方，这种不一致可能由多种机制引起，到目前仍不是很清楚。本研究结果显示在结直肠癌患者血浆中miR-206表达量降低，与组织标本文献报道结果一致，并且在肿瘤的一早期阶段就会出现，说明miR-206可能参与肿瘤形成的过程，为早期诊断结直肠癌提供了非侵人性的手段.
　　参考文献 　　

         Mauri DN,Ebner R,Montgomery RI. LIGHT,a new member of the TNF superfamily,and lymphotoxin alpha are ligands for herpesvirus entry mediator[J].Immunity,1998.21-30.
　　Zhai Y,Guo R,Hsu TL. LIGHT,a novel ligand for lymphotoxin beta receptor and TR2/HVEM induces apoptosis and suppresses in vivo tumor formation via gene transfer[J].Journal of Clinical Investigation,1998.1142-1151.
　　Morel Y,Schiano de Colella JM,Harrop J. Reciprocal ex[x]pression of the TNF family receptor herpes virus entry mediator and its ligand LIGHT on activated T cells:LIGHT down-regulates its own receptor[J].Journal of Immunology,2000.4397-4404.
　　刘相萍,王海波,刘延军. RhoA、RhoC基因在结直肠癌组织中的表达及其意义[J].中华实验外科杂志,2008,(7):888-890.doi:10.3321/j.issn:1001-9030.2008.07.027.
　　Gilboa E. How tumors escape immune destruction and what we can do about it[J].Cancer Immunology Immunotherapy,1999.382-385.
　　黄洁夫,汪谦. 分子生物学技术在外科的地位[J].中华实验外科杂志,1998.481-482.
　　Wiznerowicz M,Trono D. Harnessing HIV for therapy,basic research and biotechnology[J].Trends in Biotechnology,2005,(1):42-47.doi:10.1016/j.tibtech.2004.11.001.
　　孟春晖,李福年,张佃良. c-myc基因慢病毒载体的构建及其意义[J].中华实验外科杂志,2011,(4):543-546.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2011.04.022.