持续高表达CXC趋化因子受体-4重组慢病毒颗粒的包装鉴定及细胞迁移

          CXC趋化因子受体-4(CXCR4)是趋化因子基质细胞衍生因子一1(SDF-lcx)的特异受体.有研究表明,SDF-1cx/CXCR4轴可以促进细胞迁移「23],并且可以促进细胞存活,抑制细胞凋亡.本实验旨在构建持续高表达CXCR4的慢病毒载体及慢病毒颗粒包装鉴定,并探讨体外细胞迁移,试图通过慢病毒载体及SDF-1a/CXCR4轴使持续高表达的基因治疗和细胞治疗相结合.
          材料与方法 
          1.材料:第3代4质粒慢病毒包装系统来源于南开大学.大肠杆菌DH5a感受态购买自Tiangen公司.Taq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶XbaT,EcoRT均购自TaKaRa公司.胶回收试剂盒购自Axygen公司.胎牛血清、DMEM、胰酶一乙二胺四乙酸(EDTA)、青霉素、链霉素均购自Gibc.公司,Transwell小室为Corning-Corstar3422(美国).
          2.建立大鼠cDXA文库:取50gSDnistar大鼠大脑组织,立即放入液氮中,加Trizol100g/L,碾磨均匀,4℃12000g离心10min,吸上清,室温放置5min,按每1mlTrizol加0.2ml氯仿混匀,室温放置3min,4℃12000g离心15min,吸上清重复4℃I2000g离心15min,吸上清,按1mlTrizol加0.5ml异丙醇,冰浴15min,40C12000g离心10min弃上清,用70%乙醇漂洗2次,加乙醇4℃7500g离心10min,弃上清,室温干燥,适量焦磷酸二乙醋(DEPC)H,0溶解,一20℃保存.提取的RNA为模板,逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)获得大鼠cDNA文库,反应体系为:SxRT缓冲液8N.,l,10m,二dNTP2}1,OligoldT(20N,,m)2},1,模板10p,1,MMLV2p,1,DEPCHZ016p,1共40p,1,反应条件为:420C60min,950C5min.
          3.PCR获得目的基因CXCR4:以SDWistar大鼠为模板通过PCR获得大鼠CXCR4基因,目的基因引物为:上游引物5'-GCTCTAGAGCATGGAAATATA-CACTTCGGAT-3';下游引物5'-GGAATTCC`I"1'AGC'1'G-GAGTGAAAACTTGAG-3';反应条件:DNA变性温度为:98℃30s;退火温度为63℃30s;延伸温度为72℃90s.反应体系为:ddHzO34.61a,1,10xTag缓冲液5闪,dNTP4闪,上游引物2闪,下游引物2闪,cDNA模板2},l,Taq酶0.5p,1,总量为50μ1.
          4.构建pCDHl-CXCR4-EF1-copGFP慢病毒载体质粒:用回收试剂盒回收CXCR.4基因片段,CXCR4纯化后基因片段与pCDHl-MCS-EF1-copGFP用XbaI,EcoRI双酶切,T4DNA连接酶将CXCR4基因连人pCDHl-MCS-EFl-copGFP,作用16h.此连接载体质粒命名为pCDHl-CXCR4-EFl-copGFP.
          5.pCDHl-CXCR4-EF1-copGFP慢病毒载体质粒鉴定:取5闪连接产物转化DHSa感受态细菌,恒温箱370C培养14h,取单菌落370C,180、扩增14h,提取质粒,采用XbaI,EcoRI双酶切鉴定,并测序鉴定.
          6.HEK293T细胞和Hela细胞培养:2种细胞均在DMEM培养基中培养,培养基中加100U/ml青霉素,100.可L链霉素,10%胎牛血清(FBS),培养箱条件为370C,5%的COz.
          7第3代4质粒系统慢病毒颗粒包装:将pRsv-Rev、pMDLG/pRRE、pVSV一G和pCDHl-CXCR4-EFl-copGFP4质粒按照1:4:1:1的比例,采用PEI转染法,PEI4倍体积,质粒1倍体积室温混匀,静置10min,转染293T细胞,8h后换液,60h收集上清,离心2500r,5min,吸上清,0.45p.m的滤网过滤到50ml离心管中,超速离心40C,32000r,90min,弃上清,加双无培养基4℃过夜重悬分装,放置于一80℃保存.
          分别取0,1,2,4,8闪病毒感染Hela细胞(1x105个),各3个复孔24h后换液,继续37℃培养至48h,倒置相差显微镜观察荧光.
          8慢病毒颗粒滴度测定:按照流式细胞仪(BDFACSCalibur)要求处理细胞,铺24孔板Hela细胞,每孔细胞1x105个,DMEM500},l,37℃细胞培养箱培养24h然后从80℃冰箱每种病毒取2管超离的病毒按n}}闪/4x,1/8X1/16闪感染.感染前24孔板换液,X00闪D'1IE}}I(含40m彭L的二乙胺基乙基右旋糖昔),37℃细胞培养箱培养48h,各组设对照组及3个复孔.慢病毒颗粒感染Hela细胞24h第3天)换液,然后继续37℃培养至48h二感染后48h,按照流式细胞仪要求处理细胞,处理完细胞后通过流式细胞仪FL1通道测定绿色荧光,并根据结果计算病毒滴度TCID50/ml.
          9.实时定量聚合酶链反应(Real-timePCR)检测Hela细胞表达大鼠CXCR4mRNA水平:取感染表达CXCR4基因慢病毒颗粒72h的Hela细胞(Hela-CXCR4)及传5代之后的Hela-CXCR4分别5x106个,磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮,离心沉淀后加1mlTrizol,剧烈振荡以裂解细胞,提取总RNA并行RT-PCR,得到的PCR产物作为模板L4·,行Real-timePCR,引物分别为:甘油醛_3_磷酸脱氢酶(GAPDH):上游5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3',下游5'-TGGT-GAAGACGCCAGTGGA-3';CXCR4:上游5'-CATCT-TCTTGACTGGCATAGTGGGC-3’,下游5’-CTGCTGTA-AAGGTTGACGGTGTAG-3'.反应体系条件如下:第1步:95℃,5min,l个循环.第2步:95℃,30s;56℃,30s;720C30s;40个循环.第3步:720C,2min,1个循环.
          10.Transwell小室观察细胞迁移:小室的直径为6.5mm,小室孔径为85Nm分别将Hela细胞和Hela-CXCR4细胞置于小室上层,数量为1x10)个上层培养基为100闪,下层为600闪(分lJ}{加SDF'-1a0,50,100p,g/1.),细胞培养箱培养5h,上层未迁移到下层的细胞棉签擦掉,下层细胞用4%的多聚甲醛固定30min,结晶紫染色20min、在显微镜下分另}}取5个视野计数细胞迁移数量.
         

          结果
          1.CXCR4基因的获得:以.D\1文库为模饭经过PCR获得CXCR4基因,通过琼脂糖凝胶电泳,获得1050hp的条带,成功获得CXCR4基因(图1).
          2.构建pCDHI-CXCR4-EFl-copGFP慢病毒载体质粒:经连接后转化DH5.感受态大肠杆菌,取单菌落,提取质粒.采用XbaI,EcoRI双酶切后,琼脂糖凝胶电泳出现2条带分别为7544by和1050by,条带大小均正确(图2),测序显示构建pCDHl-CXCR4-FF1-copGFP慢病毒载体质粒成功.
          3.成功包装第3代慢病毒颗粒:采用prl转染法,用第3代慢病毒4质粒系统共转染293T细胞,包装出慢病毒颗粒一并感势Vela细胞72h以及传5代之后,分别在倒置相差显微镜下观察到强绿色荧光蛋白的表达.
          4.流式细胞仪慢病毒滴度测定:以0闪病毒组作为阴性对照,通过流式细胞仪测定发荧光细胞比例,通过软件分析得病毒滴度为7.89x10'TCID50/ml.
          5.Real-timePCR检测Hela细胞表达大鼠CXCR4mRNA水平:通过Real-timePCR检测,Hela细胞感染高表达CXCR4慢病毒颗粒72h与14d之后,持续高表达大鼠CXCR4蛋白的Hela细胞分别为空白载体对照组表达CXCR4mRNA的78.29,58.93倍.
          6.Transwell小室观察细胞迁移:为了观察Hela-CXCR4细胞迁移情况,本实验分别用不同的SDF-1.浓度置于小室下层,Hela-CXCR4细胞组比空载体慢病毒感染Hela细胞(Hela-CDHl)组迁移数目多,并且观察到随着SDF-1.浓度的升高,迁移的细胞数目也越多二通过CXCR4特异性抑制剂AMD3100加人小室下层后观察到细胞迁移数量减少.
          讨论
          我们使用第3代慢病毒体系,通过慢病毒载体持续高表达CXCR4基因,并通过Real-timePCR检测mR\A水平表达明显增高慢病毒载体是以人类免疫缺陷I病毒(HIV-1)为基础发展起来的基因治疗载体区jJ小一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达.第3代慢病毒可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果基因治疗可以通过改造活细胞的遗传物质达到在基因水平上治疗疾病的目的.细胞治疗为人类疾病治疗提供了一种新的治疗手段,基因修饰的细胞治疗已经在神经系统、心血管系统、泌尿系统等等都有广泛的研究但是细胞治疗面临的关键问题是:细胞存活、细胞靶向迁移的能力等sfi}
          持续高表达CXCR4白勺细胞对于趋化因子SDF-1cx有明显的细胞靶向迁移能力,并有浓度依赖性.通过Transwell试验检测细胞是与SDF-1a/CXCR4轴有高度亲和力,能相互结合而构成的藕联分子对,SDF-1cx/CXCR4轴特异结合是其生物学功能的分子基础,与细胞间信息传递、细胞迁移、介导免疫及炎性反应、调控造血干细胞迁移及归巢、器官发育等等均有着密切关系SDF-1a/CXCR4轴与细胞迁移关系密切,能够促进高表达CXCR4的细胞向高浓度SDF-1.区域迁移.
          参考文献 
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