微生物酶通过重新激活小鼠胃肠道中的三氯生来诱发结肠炎

三氯生(TCS)是一种在数千种消费品中被发现的抗菌剂，新兴研究支持三氯生(TCS)在动物模型中会加剧结肠炎和结肠炎相关的结直肠肿瘤发生。虽然TCS的肠道毒性需要肠道微生物群的存在，但所涉及的分子机制尚未明确。本研究表明肠道共生微生物介导结肠中TCS的代谢激活并驱动其肠道毒理学。通过一系列体外、离体和体内方法，我们确定了所涉及的特定微生物β-葡萄糖醛酸酶(GUS)，并确定了在肠道中代谢激活TCS所需的分子基序。我们表明靶向抑制细菌GUS酶可消除TCS的促结肠炎作用，支持特定微生物蛋白在TCS毒性中发挥重要作用。综上，我们的研究结果定义了肠道微生物促进TCS代谢激活和肠道毒性的机制，并强调了在评估环境化学物质的毒性潜力时考虑肠道微生物的贡献的重要性。

结果

1 小鼠肠道中独特的TCS代谢谱 本研究首先试图确定下消化道是否表现出与其他组织不同的TCS代谢特征。我们通过饮食用80 ppm TCS处理小鼠4周，然后使用LC-MS/MS分析一系列小鼠组织中的TCS及其代谢物浓度。根据我们之前的研究确定了TCS治疗方案来模拟人类暴露于TCS的情况。我们发现，在TCS暴露后，在肝脏、胆汁、心脏和小肠中发现的主要TCS化合物是无生物活性的共轭代谢物TCS-G。相比之下，小鼠盲肠和结肠以游离TCS为主。在小鼠小肠第4段食糜中发现的TCS代谢物为36.9%游离TCS、55.4%TCS-G和7.7%硫酸结合TCS(TCS-硫酸盐)；而粪便中含有99.1%游离TCS，只有0.7%TCS-G和0.2%TCS-硫酸盐。这些结果表明，与其他组织相比，结肠具有独特的TCS代谢特征，并且独特地含有几乎普遍存在的游离TCS。 为了进一步验证这一发现，我们用较低剂量的TCS治疗小鼠并分析其在结肠组织中的代谢特征。我们通过饮食给予1、10和80 ppm的TCS处理小鼠4周，发现在所有测试剂量下，肠道组织具有相似的TCS代谢特征，并且以大量游离TCS为特征：结肠食糜、盲肠食糜和粪便中检测到的~94-99%的TCS种类以游离TCS的形式存在；而在其他地方观察到TCS及其代谢物的混合物。此外，LC-MS/MS显示TCS暴露对TCS肠道浓度的剂量依赖性效应：饲粮中添加1、10和80 ppm TCS后，结肠食糜中游离TCS浓度分别为1.5、14.7和92.2 pmol/mg组织。这些发现进一步支持结肠具有独特的TCS代谢谱，并含有大量的游离TCS。

小鼠和人类的TCS暴露导致结肠中游离TCS的积累。a通过饮食用80 ppm TCS处理小鼠4周后，盲肠食糜和粪便内容物显示出高水平的游离TCS，而在其他地方观察到TCS和代谢物的混合物(每组n=10只小鼠)。b通过饮食给予1、10和80 ppm的TCS治疗小鼠4周。在所有测试剂量下，包括粪便、结肠食糜和盲肠食糜在内的肠道组织均表现出高水平的游离TCS和低水平的代谢物(每组n=7-8只小鼠)。c洗脱期后，人类受试者使用个人护理产品(含或不含TCS)长达4个月。收集了23个粪便样本，但仅收集了7个尿液样本。d TCS暴露人类受试者粪便样本中的主要化合物是游离TCS(n=23)，而TCS暴露人类受试者尿液样本中的主要化合物是TCS-G(n=7)。数据为平均值±SEM。缩写：TCS：三氯生，TCS-G：三氯生-葡糖苷酸，TCS-sulfate：三氯生-硫酸盐。 2 人体肠道中独特的TCS代谢谱 为了拓宽我们对肠道中TCS代谢谱的理解，我们接下来分析了人类受试者的TCS代谢。我们使用了之前一项研究的尿液和粪便样本，在该研究中，招募的人类受试者首先经历了一个洗脱期(不使用含有TCS的产品)，然后被随机分为两组，分别使用个人护理产品，如含或不含TCS的牙膏长达4个月(参见图1c中的实验方案)。先前的数据已经确定，人类主要通过牙膏直接通过口腔进入胃肠道而接触到TCS。 首先，我们测试了在使用含TCS的产品后，是否可以在粪便或尿液样本中检测到TCS及其代谢物。正如预期的那样，在清除期之后，我们发现大多数人类受试者在研究开始时的TCS水平非常低(t=0)；尽管有两名受试者(一名在对照组，一名在TCS组)即使在t=0时也显示出可检测的TCS水平，这可能是由于TCS在环境中普遍存在的性质。LC-MS/MS显示，即使在使用含TCS产品1个月后，在TCS暴露受试者的尿液和粪便样本中也检测到TCS及其代谢物，但在使用不含TCS产品的对照受试者中未检测到。 接下来，我们分析了暴露于TCS的人类受试者中TCS的代谢特征。LC-MS/MS显示，在所有测试的TCS暴露受试者中，粪便样本中的主要化合物是游离TCS，而尿液样本中的主要化合物是TCS-G。人粪便中TCS、TCS-G和TCS-硫酸盐的平均摩尔浓度比为99.2%:0.8%:0.0%，而尿液中为1.6%:98.4%:0.0%。在粪便中测得的游离TCS浓度很高，可达~1 pmol/mg组织，相当于~1 µM。相比之下，尿液中的TCS浓度在低nM范围内。总之，这些结果表明，与尿液中发现的相比，人类肠道表现出独特的TCS代谢特征，并且含有大量的游离TCS。 3 肠道菌群在体外和体内将结肠中的TCS-G转化为TCS 上述数据显示，从肠道的近端到远端区域，TCS的浓度增加，而TCS-G的浓度降低。因此，我们假设肠道微生物群参与TCS-G向TCS的转化，导致TCS在下消化道中的积累。为了验证这一假设，我们使用了多种方法，包括肠道细菌的体外培养、抗生素介导的体内肠道细菌抑制和无菌小鼠，以检查肠道微生物群在TCS结肠代谢中的作用。 首先，我们在厌氧条件下培养肠道细菌，并测试培养的细菌是否可以在体外将TCS-G转化为TCS。我们发现来自小鼠和人类的粪便细菌能够以高于对照的水平催化TCS-G向TCS的转化。这些结果支持了厌氧培养的肠道细菌可以催化TCS-G去葡萄糖醛酸化产生TCS的结论。 接下来，为了测试肠道微生物群是否参与体内结肠中TCS-G向TCS的转化，我们检查了肠道细菌的抗生素抑制是否会改变结肠食糜中TCS与TCS-G的浓度。我们使用了以前研究中的抗生素混合物，表明这种混合物有效地减少了小鼠的肠道细菌。为了进一步验证这一点，我们使用16S rRNA基因作为标记分析了总粪便微生物生物量。与我们和其他人之前的研究一致，所使用的抗生素混合物导致小鼠粪便细菌减少(补充图S4)。接下来，LC-MS/MS研究表明，抗生素处理降低了游离TCS的浓度，同时使粪便中TCS-G的浓度增加了六倍。这些结果支持肠道细菌有助于体内TCS-G向TCS转化的结论。 为了进一步检查肠道细菌在TCS结肠代谢中的作用，我们测试了抗生素作用的时间依赖性。用或不用抗生素混合物对小鼠进行预处理，然后一次性口服灌胃TCS，然后在t=4、8、12和24 h时检查TCS的代谢特征。我们发现肠道细菌的抗生素抑制以时间依赖性方式降低了小鼠结肠食糜中的TCS，增加了TCS-G。曲线下面积(AUC)分析显示，在24 h内，抗生素处理使TCS降低了约40%，而结肠食糜中的TCS-G增加了约200倍。这一发现与上述结果一致，进一步支持了肠道细菌有助于结肠中TCS-G转化为TCS的结论。 我们使用无菌小鼠模型进一步检查肠道微生物群在TCS结肠代谢中的作用。我们通过一次性灌胃TCS对常规小鼠或无菌小鼠(建立在C57BL/6背景下)进行TCS治疗，然后分析t=4和8 h时结肠TCS代谢谱。4 h和8 h的时间点是根据我们上面的时间进程研究确定的。与常规小鼠相比，无菌小鼠在其结肠食糜中表现出TCS减少和TCS-G增加，与抗生素实验的结果一致。为了进一步验证这一发现，我们比较了不同品系Swiss Webster无菌小鼠和常规小鼠的TCS结肠代谢。与常规动物相比，无菌Swiss Webster小鼠结肠食糜中TCS浓度降低，而TCS-G浓度增加。我们观察到无菌小鼠结肠中存在游离TCS，这可能来自从食物中摄入的TCS：在小鼠暴露于饮食80 ppm TCS后，在小肠食糜中检测到游离TCS，部分摄入的TCS在小肠中保持不变。这种情况也可能发生在无菌小鼠中，小肠中的游离TCS会随着食糜的流动进入结肠。总之，粪便细菌的体外培养研究、抗生素介导的体内肠道细菌抑制和无菌小鼠模型的结果支持了共生微生物在结肠中将TCS-G转化为TCS的结论。

肠道细菌在体外和体内将TCS-G转化为TCS。a来自小鼠和人类的粪便细菌在体外将TCS-G转化为TCS(每组n=3)。b C57BL/6小鼠通过饮食摄入80 ppm TCS，在饮用水中加入或不加入抗生素混合物，持续4周。c抗生素治疗降低了小鼠粪便中的TCS并增加了TCS-G含量(每组n=10只小鼠)。d C57BL/6小鼠用或不用抗生素预处理7天，然后一次性口服管饲8 mg/kg TCS。e、f抗生素治疗以时间依赖性方式降低小鼠结肠食糜中的TCS，增加TCS-G。左：结肠食糜的时程变化(每个时间点每组n=5只小鼠)。右图：曲线下面积(AUC)分析。g常规或无菌C57BL/6小鼠接受一次性口服管饲8 mg/kg TCS。h与传统小鼠相比，无菌小鼠结肠食糜中的TCS降低，TCS-G升高(每个时间点每组n=5只小鼠)。数据为平均值±SEM。两组比较采用Shapiro-Wilk检验验证数据的正态性；当数据呈正态分布时，采用双侧t检验确定统计性；否则，性采用Wilcoxon-Mann-Whitney检验确定。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

4 特定肠道微生物β-葡萄糖醛酸酶(GUS)同源物将TCS-G转化为TCS 接下来，我们试图将特定的肠道微生物酶与TCS-G转化为TCS联系起来。由于肠道β-葡萄糖醛酸酶(GUS)已被证明可将多种葡萄糖醛酸代谢物转化为其相应的糖苷配基，因此我们假设肠道微生物GUS同源物会催化TSC-G转化为TCS。人类和小鼠肠道微生物组已被证明含有数百种独特的肠道微生物GUS酶，它们对不同的葡糖苷酸表现出不同的底物特异性。先前的研究表明，微生物GUS酶可以根据活性位点结构和/或辅因子结合分为七个不同的进化枝。我们创建了一组32种纯化的肠道微生物GUS