不同肿瘤中癌细胞状态的复发及其与肿瘤微环境的相互作用

研究背景

肿瘤中转录组异质性是导致肿瘤进展、转移和治疗失败的主要因素。通过scRNA-seq技术已实现对单个肿瘤细胞的无偏见转录组分析，并揭示了同一肿瘤组织恶性细胞之间的异质性，这种转录异质性被组织成癌细胞状态。先前的研究结果表明存在与应激反应、干扰素反应和缺氧相关的癌细胞状态，且癌细胞状态与肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中特定细胞类型存在因果关系。然而，尚不清楚癌细胞状态在多大程度上跨越了肿瘤类型，是否构成癌症的一般特征以及癌细胞状态与TME是否存在相互作用。因此，需要比较不同的肿瘤类型来寻找肿瘤异质性的共同点，并系统地研究癌细胞状态和TME中非癌细胞类型之间的关系。

研究策略

研究人员对收集的19例未治疗患者的新鲜原发肿瘤组织进行scRNA-seq，并且收集了公共数据库的肿瘤单细胞转录组样本。共涉及15种癌症类型，包括卵巢癌（ovary carcinoma，OVCA）、子宫内膜癌（endometrium carcinoma，UCEC）、乳腺癌（breast carcinoma，BRCA）、前列腺癌（prostate carcinoma，PRAD）、肾癌（kidney carcinoma， KIRC）、肝癌（liver carcinoma，LIHC）、结肠癌（colon carcinoma，COAD）、胰腺癌（pancreas carcinoma，PDAC）、胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）、胆管癌（cholangiocarcinoma，CHCA）、肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）、头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSC）、皮肤鳞状细胞癌（skin squamous cell carcinoma，SKSC）、胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）和少突胶质细胞瘤（oligodendroglioma，OGD），如图1a。基于这15种癌症类型的scRNA-seq数据，研究人员定义了一系列在多个癌症类型中共享的基因模块，并基于基因模块量化了每个恶性细胞的细胞状态。随后，对收集的10例未治疗患者的新鲜原发肿瘤组织（OVCA∶UCEC∶BRCA∶PDAC∶GIST∶LIHC=2∶1∶3∶1∶2∶1）进行空间转录组测序，以探究特定癌细胞状态附近的细胞类型分布。通过小鼠模型，研究人员进一步验证干扰素的癌细胞状态会随着附近淋巴细胞的减少而减弱。

研究成果

1. 不同类型癌症的单细胞图谱

研究人员首先探究了收集的19例肿瘤组织的单细胞图谱。为了区分恶性细胞与非恶性细胞，研究人员借助文献检索获得的细胞类型标志基因及singleR软件进行细胞类型注释，结果显示，细胞主要被注释为上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、髓样细胞、B细胞、T细胞以及自然杀伤细胞。而后，进一步对恶性细胞进行识别：第一，借助文献检索获得的特定肿瘤细胞标志基因识别恶性细胞；第二，依据恶性细胞通常具有异常的拷贝数状态来进一步验证识别的恶性细胞；第三，根据肿瘤间异质性对来自不同肿瘤的假定恶性细胞进行降维，以验证它们是否形成单独的簇。

为了扩展研究的癌症类型范围，研究人员进一步收集了公共数据库的肿瘤单细胞转录组数据，并同样进行细胞类型的注释及恶性细胞的识别。

2. 不同癌症类型间重复出现的基因模块

基于基因模块定义细胞状态，不仅可以通过组合模块更加灵活复杂地表征细胞状态，同时还能减少样本和研究中技术差异的影响。为此，研究人员基于非负矩阵分解对每个样本的恶性细胞进行分析，确定共表达基因集的基因模块。随后，鉴别不同肿瘤类型间重叠的模块，并通过GO通路以及已知细胞类型的标志基因进行模块注释。共确定16个多癌种共享的基因模块，每个模块由9到297个协同表达的基因组成。研究人员发现一些模块在多种不同器官系统的癌症中被广泛检测到，包括细胞周期（cycle）、应激反应（stress）、干扰素反应（interferon）、缺氧（hypoxia）、氧化磷酸化（oxphos），以及金属硫蛋白反应（me[x]tal），这些模块主要涉及细胞特定的生物学过程和反应。而另一些模块则显示器官系统特异性，比如肺泡模块（alveolar）、纤毛相关基因模块（ciliated）、基底细胞模块（basal）、鳞状细胞模块（squamous）、腺体模块（glandular）、星形胶质细胞（astrocyte，AC）样模块、少突胶质细胞（oligodendrocyte progenitor cell，OPC）样模块和神经祖细胞（neural progenitor cell，NPC）样模块。此外，还包括2个与上皮细胞间质化相关的模块，即在HNSC、SKSC和GBM中存在的部分间质模块（partial mesenchymal module，pEMT），以及在PDAC、CHCA、LUAD和GBM中存在的完全间质模块（complete mesen chymal module，cEMT）。

同时，研究人员发现，绝大多数模块在相应器官的正常上皮细胞中也存在，尽管程度较低。这表明这些模块并不是在癌症中新产生的，而是原本存在于正常组织中，是在正常组织癌变过程中逐渐被选择出来，并在癌症中呈现出更多样化的表达。

3. 基因模块定义癌细胞状态

研究人员借助基因表达可以计算每个恶性细胞的基因模块得分，从而量化每个癌细胞状态。简单来说，通过1,000次随机取样，获得1,000个与基因模块同等数量的基因列表，并计算模块基因平均表达超过这1,000个基因集平均表达的比例，从而评估每个细胞特定模块的细胞状态。研究人员基于恶性细胞的模块，对19例本研究测序的单细胞数据分数进行UMAP降维，然后用每个癌细胞中得分高的模块对细胞进行注释。结果表明，癌细胞不再按照患者个体或癌症类型进行聚集，而是按照其高表达的模块来聚集。随后，研究人员发现有些模块呈现共表达，如pEMT与干扰素反应及应激反应模块共表达。以上结果表明，基于基因模块定义的癌细胞状态通常不代表特定的肿瘤实体。

由于一些模块也存在于正常组织中，因而研究人员比较了正常组织和癌组织中表达每个模块的细胞比例，以分数大于0.5视为模块表达。在所有癌症类型中，pEMT模块在所有癌症类型中表达的比例都大于其正常组织，这与肿瘤进展中经常发生上皮细胞-间充质细胞转化相一致。由于正常肺组织和皮肤都具有鳞状细胞，因此研究人员没有观察到LUAD、SKSC与其正常组织间鳞状细胞模块的细胞比例差异。与之相反的是，PDAC中鳞状细胞模块的细胞比例升高，而其正常胰腺组织通常以导管细胞为主，表明PDAC癌细胞可能发生了鳞状分化。此外，与正常皮肤组织相比，SKSC中腺体模块的细胞比例上升。这些变化都表明，癌症组织中既保留了正常组织的模块，又随着疾病进展而表现出其他细胞类型的模块。

4.  癌细胞状态与TME的相互作用

为了探究癌细胞状态与TME中细胞类型的关系，研究人员开展了空间转录组测序。由于空间转录组中spot并不是单细胞分辨率，因此通过非负线性小二乘回归方法以及单细胞数据作为参考将spot分为三个部分：仅包含恶性细胞，即“Malignant”；包含免疫细胞和基质细胞，即“Normal”；前两者重叠的spot，即“Both”。研究人员首先探究了“Normal”和“Both”spot的细胞类型组成，以了解在恶性细胞存在时细胞组成是如何变化的。结果发现，在包含恶性细胞的spot中内皮细胞比例降低，表明肿瘤中不充分的血管生成。相反，中性粒细胞的比例升高。进一步研究人员还分析了抗肿瘤的M1和促肿瘤的M2巨噬细胞的比例，发现M1/M2比值在“Both”spot中高于“Normal”spot。这两个现象表明，在癌细胞附近具有强大的抗肿瘤免疫反应。 

接下来，研究人员尝试探究特定癌细胞状态与TME的相互作用。为此，研究人员计算每个“Malignant”spot的模块得分，并通过“neighborhood score”和“proximity score”两个指标来评估特定癌细胞状态和周围TME中细胞组成的关系。其中“neighborhood score”表示特定癌细胞状态的spot在其邻近区域内感兴趣细胞的比例；“proximity score”表示特定癌细胞状态的spot与感兴趣细胞间的距离。“Malignant”spot模块得分与“neighborhood score”间相关性分析揭示了一些癌细胞状态与TME特定细胞的共定位现象。比如在BRCA NYU2样本中，“Malignant”spot的干扰素反应模块得分与该spot巨噬细胞的“neighborhood score”和“proximity score”呈正相关，表明干扰素反应的癌细胞状态周围富集巨噬细胞。对所测的10个空间转录样本中也可以观察到这种关系，进一步表明这种关系的普遍性。此外，也可以观察到其他一些相互作用，如cEMT和pEMT的癌细胞状态与成纤维细胞、内皮细胞的共定位，干扰素反应的癌细胞状态与T细胞共定位等。综上表明，癌细胞状态与TME的细胞组分密切相关，要么癌细胞状态改变其周围的细胞类型组成，要么TME中细胞类型诱导特定癌细胞状态的产生。

5. 干扰素反应受肿瘤微环境的调节

在肿瘤中IFNα和IFNβ由癌细胞和树突状细胞分泌，导致T细胞启动和抗肿瘤活性。为了进一步测试干扰素反应与TME中T细胞之间的关系，异体移植小鼠模型被使用。在该模型中，通过基因敲除可以容易干扰TME中细胞的组成。首先，研究人员在具有正常免疫系统的小鼠肿瘤异体移植模型中进行肿瘤组织的scRNA-seq分析，结果表明，小鼠异体移植模型可以重现癌症患者肿瘤样本中存在的5个基因模块：细胞周期、应激反应、干扰素反应、缺氧和腺体模块。接下来，研究人员在缺乏T细胞和B细胞的Rag1-/-小鼠中进行肿瘤组织的scRNA-seq分析，结果显示，细胞周期、应激反应、缺氧以及腺体模块的表达频率在野生型和Rag1-/-小鼠异体移植模型中没有差别；与之相反的是，干扰素反应模块的表达频率在Rag1-/-小鼠异体移植模型中降低。此外，研究人员进一步发现干扰素反应模块表达细胞的频率也因肿瘤位置而异。这进一步通过实验证明了干扰素反应的癌细胞状态与TME中的T细胞相互作用。

结论

本研究通过泛癌单细胞图谱发现了不同肿瘤类型间重复出现的基因模块，并基于基因模块定义细胞状态，从而减少样本和研究中技术差异的影响。随后研究发现模块共表达现象的存在，这表明癌细胞状态不能明确定义为细胞类型：由于模块可能组合表达而不是相互排斥，从而导致细胞状态连续变化而非形成离散簇。随后借助空间转录组数据，本研究揭示了多种癌细胞状态与TME中特定细胞类型的相互作用，并基于小鼠模型验证了干扰素反应的细胞状态与T细胞的相互作用。总之，该研究结果为探究癌细胞状态如何与肿瘤微环境相互作用以形成能够免疫逃逸、耐药性和转移的组织系统提供了框架。