使用单个B细胞技术制备兔单克隆抗体

单克隆抗体的制备是一项复杂而精细的工作，单B细胞抗体开发技术是近年来新兴的单克隆抗体制备技术。它是将单细胞分离鉴定技术结合多种PCR技术形成的一种单克隆抗体体外筛选及表达体系，以单个B细胞为起始点，利用每个B细胞只产生一种特异性抗体的特性，直接从单个B细胞中扩增出抗体基因，进而获得抗原特异性抗体。

B细胞单克隆抗体制备技术具有高通量、高效率、低细胞数等优点，所制备的抗体保留了丰富的基因多样性及轻重链可变区天然配对，是新、高效的抗体筛选方法之一。特别是在快速应对病原微生物传染病的抗体开发上有着巨大优势。

使用单个B细胞技术制备兔单克隆抗体其流程主要包括三个重要步骤：鉴定和分离单个B细胞、扩增和克隆抗体基因、重组抗体的表达与鉴定以及抗体的扩大培养和纯化。普健生物Xten™Mab Single B 兔单克隆抗体制备无需兔骨髓瘤细胞商业化授权，采用独特的细胞分选和富集技术，实现了单B细胞平台从特异性到功能性的筛选、并保证Assay结果的准确度，提高总体筛选的工作效率、减少下游表达验证的工作量、缩短抗体发现的周期，为抗体药开发节省了宝贵的时间

Xten™ Mab Single B 兔单克隆抗体开发流程 

鉴定和分离单个B细胞

单个B细胞的分离通常有随机分离和抗原特异性分离两种。免疫兔子后获得抗原特异性抗体浓度较高的血样，从中分离B细胞，操作简单。方法主要有显微操作、激光捕获显微切、荧光激活细胞分选法。还有一种适合于抗肿瘤抗体、自身免疫抗体等特异性抗体含量较低的抗原特异性分离方法，该方法需分离抗原特异性B细胞，方法包括：荧光标记抗原多参数细胞分、抗原标记磁珠分选法、微雕法、以及细胞微阵列芯片等。

扩增和克隆抗体基因

细胞分选时，通常需将单个B细胞分至内含适量细胞裂解液、RNA 酶抑制剂和PCR反应试剂的适当容器中进行B细胞培养，然后对分泌抗体检测阳性的孔进行进RNA提取逆转录。通常采用合适的引物进行巢式或半巢式逆转录 PCR (Nested or semi-nested RT-PCR)扩增抗体可变序列。

表达、筛选和鉴定抗原特异性抗体

鉴定抗体的抗原特异性和生物活性前需将携带有抗体基因的表达载体在相应系统中表达，如原核表达系统、真核表达系统。通过亲和层析和离子交换层析纯化到的抗体，也可通过免疫沉淀、控斑法、空斑减少中和测定法流式分析法、活细胞成像测定法、体内药物活性测定法等方法进一步测定抗体与抗原的特异性、亲和力以及中和活性保护活性等生物学特性。

单个B细胞技术由于可以直接获得重轻链正确配对的抗体序列，变得越来越有吸引力，某些方面具有不可替代的优势。但是由于该技术对设备的高度依赖性，并且对抗原标记、引物设计的高效性和准确性方面有较高要求，对实验人员技术要求较高。新型的Single B 兔单克隆抗体开发技术平台利用B细胞分选富集策略，在流式分选设备的支持下，有效富集抗原特异性B细胞，提高B细胞体外培养的成活率，保留B细胞的多样性，可开发出不同应用需求的抗体，且具有独特优势。

高特异性：与小鼠和其他啮齿动物相比，兔免疫系统更优，产生的抗体特异性更强，亲和力更高

高稳定性：与常规小鼠生产的单克隆抗体相比，兔IgG结构稳定性高

高亲和力：兔的B细胞成熟过程产生的亲和力是啮齿动物的10-100倍

高多样性：兔拥有丰富的B细胞反应库，其产生的抗体在表位变异、突变、构象变化等方面优势，且多样性高