恒定磁场对Schwann细胞氧化损伤的保护作用

【摘要】  目的：探讨恒定磁场对Schwann细胞氧化损伤保护作用的机制。方法：用体外传代纯化培养的Schwann细胞建立氧化损伤模型，将培养细胞分为氧化损伤组，恒定磁场（4?mT）保护组及正常组。采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）检测细胞的活性，用生化技术检测细胞内超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛(MDA)的含量，用免疫组织化学方法检测各组半胱氨酸天冬氨酸酶（Caspase3）的表达。结果：与正常组及保护组相比，HB2BOB2B处理组细胞活性降低（P＜0.01)，SOD含量明显减少（P＜0.01)，MDA含量明显增加（P＜0.01)，Caspase3表达呈强阳性，恒定磁场保护组细胞存活率明显升高（P＜0.01),SOD含量较损伤组高（P＜0.01)，MDA含量明显减少（P＜0.01)，Caspase3表达弱阳性。结论：4?mT恒定磁场能通过抗氧化损伤保护Schwann细胞。

【关键词】  周围神经系统 模型 神经学 损伤 细胞凋亡

      AProtective effects of the invariable magnetic field on

    oxidative injured Schwann cells

    ZHANG Jie, LI Zhenhua, SUN Jinhao, BAO Lihua, LIU Yuepeng

    （Department of Anatomy, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, Shandong, China）

    ［ABSTRACT］  ob[x]jective： To investigate the protective effects of the invariable magnetic field on  oxidative injured Schwann cells. Methods： Schwann cells were randomly divided into an experimental group and control groups. MTT was used to observe the cell activity of the Schwann cells with hydrogen peroxide. A biologic chemistry method was used to detect the content of intracellular superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde （MDA）. An immunohistochemistry method was used to detect the ex[x]pression of Caspase3. Results： The results showed that cell activity decreased in oxidative injured Schwann cells. However, these changes were significantly reversed in the  invariable magnetic field preconditioned group. Conclusion： An invariable magnetic field has a good antioxidant effect on Schwann cells.

    ［KEY WORDS］  Peripheral nervous system; Models, neurological; Injuries; Apoptosis    Schwann细胞是周围神经系统特有的胶质细胞，包绕轴突形成有髓纤维或无髓纤维，并分泌多种与神经系统发育和再生密切相关的神经因子［1］。近年来的研究发现，氧化应激反应后，氧自由基的增多导致Schwann细胞凋亡是周围神经病变的发病机理之一［2］。本研究主要观察了4?mT恒定磁场对氧化损伤模型中Schwann细胞的保护作用，为揭示恒定磁场治疗周围神经病变提供理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  实验试剂  DMEM/F12、胰蛋白酶均购自Gibco公司；噻唑蓝［(34,5dimethylthiazolzyl)2,5diohenyltetraazolium bromide, MTT］、胶原酶由Sigma公司提供；S100 抗体、Caspase3 抗体系福建迈新公司产；胎牛血清(fetal calf serum, FCS)购自杭州四季青公司；考马斯亮兰蛋白测定试剂、超氧化物歧化酶(hepatocuprein,SOD)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

    1.1.2  实验仪器  磁铁由淄博市盛金磁铁制造有限公司提供；CT3型特斯拉计系上海第四制表厂产； Multiskan MK3 酶标仪购自芬兰Labsystems公司；VC750超声细胞粉碎机系Sonics Material INC公司产；隔音箱购自宁波新芝生物科技股份有限公司；UV2102PCS型尤尼柯紫外可见分光光度计由上海尤尼柯仪器有限公司提供；SHZ22水浴恒温振荡器系江苏省太仓县医疗器械厂产；旋涡震荡器由江苏海门其林医用仪器厂提供。

    1.2  方法

    1.2.1  Schwann细胞的纯化及鉴定  将SD新生大鼠用75%的酒精浸泡消毒后，固定在取材板上，分离坐骨神经和臂丛神经，置于DHanks液中，在解剖镜下仔细剥离神经外膜，尽可能去除神经束膜，并剪成粒状。用终浓度为0.125%的胰蛋白酶和0.03%的胶原酶两种酶混合在一起进行消化，将获取的细胞接种在含10%的FCS的DMEM/F12培养基中，每日在倒置显微镜下观察细胞生长情况，每3?d换液1次，在培养3?d时做S100免疫组化染色，鉴定Schwann细胞，见图1。

    1.2.2  实验分组  细胞培养时分为3组。① 过氧化氢损伤组：在培养基中加入终浓度为0.5%的H2O2；② 恒定磁场（4?mT）保护组：0.5%的H2O2＋恒定磁场；③正常对照组。

    1.2.3  MTT比色微量分析  细胞终止培养前4?h，每孔加入MTT溶液15?μl（5?mg/ml），继续培养4?h后吸取上清液，用DMSO溶解MTT结晶，然后将培养板放在Multiskan MK3酶标仪上，试验波长570?nm，测定每孔OD值。

    1.2.4  SOD的检测  培养12?h后，收集Schwann细胞，用超声细胞粉碎机对细胞进行粉碎，检测各组细胞内SOD的含量。

    1.2.5  MDA的检测  培养12?h后，收集Schwann细胞，用超声细胞粉碎机对细胞进行粉碎，检测各组细胞内MDA的含量。

    1.2.6  细胞内Caspase3的表达  培养12?h时,取培养细胞做Caspase3免疫组织化学显色，4%多聚甲醛固定30?min, 按SP方法进行二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色，阳性对照以PBS缓冲液替代一抗,显微镜观察，细胞内见棕黄色颗粒为阳性。

    2  结  果

    2.1  原代细胞培养及观察  正常Schwann细胞呈梭形，胞体较小，有两个细长的突起，48 72?h后去除阿糖胞苷，镜下的Schwann细胞的纯度明显增加，见图2。

    加入H2O2后，在倒置显微镜下观察，胶质细胞发生改变，细胞突起萎缩，胞体肿胀变圆，细胞数量减少，见图3。恒定磁场保护组细胞在倒置显微镜下观察，可见Schwann细胞胞体梭形，突起较损伤组长，细胞数量多，见图4。

    2.2  MTT检测结果  与损伤组比较，恒定磁场保护组的OD值明显增高（P＜0.05），见表1。

    OD 值损伤组0.663?0±0.128?1保护组正常组0.939?9±0.062?5*

    *2.3  SOD检测结果  SOD检测结果显示，恒定磁场保护组的Schwann细胞的SOD值明显高于损伤组（P＜0.05）,见表2。

    SOD活力（U/mg prot）损伤组20.097?7±0.112?4保护组29.342?4±0.045?6*正常组

    *2.4  MDA检测结果  MDA检测结果显示，恒定磁场保护组的Schwann细胞的MDA值明显低于损伤组（P＜0.05）,见表3。

    MDA（c/nmol·ml-1）损伤组58.799?8±1.779?5保护组11.199?9±0.025?3*正常组11.852?0±0.562?7*

    *2.5  各组之间Caspase3表达的形态学观察  正常组Schwann细胞的Caspase3反应呈弱阳性，细胞内棕色颗粒几乎没有，见图5。损伤组呈强阳性，可见到阳性的棕色颗粒，见图6。保护组呈弱阳性，棕色颗粒很少，见图7。

    3  讨  论

    近年来研究证明，周围神经损伤早期有一部分正常雪旺细胞Caspase3表达呈弱阳性（×200） Schwann细胞被动的被体内新产生的氧化剂杀死。H2O2是一种强氧化剂，在紫外线或体液中金属离子的作用下可产生O-2和OH-等多种自由基，并由此引发连锁反应产生更多自由基［3］，这些自由基能诱导细胞的凋亡。Schwann细胞凋亡导致细胞过度丢失，给外周神经损伤修复带来困难。因此如何保护Schwann细胞免于凋亡的丢失，成为研究的热点。我们在实验中观察了HB2BOB2B造成的Schwann细胞氧化损伤以及恒定磁场的干预保护作用。

    已有研究表明［4］，作为抗氧化剂的SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除体内超氧阴离子自由基，治疗超氧阴离子自由基引起的疾病，保护细胞免受自由基的损伤，SOD活力的高低反应了抗自由基能力的大小。Caspase3在细胞凋亡中起重要作用［5］：① 灭活阻止细胞凋亡的细胞内物质；② 通过对细胞结构的直接酶解而促进凋亡；③ 通过对一些细胞骨架调节相关蛋白质的酶解改变细胞结构导致细胞凋亡。

    我们的实验结果显示，恒定磁场保护组的SOD含量较H2O2组明显升高，MDA含量明显降低，Caspase3反应为弱阳性。表明恒定磁场具有一定抗氧自由基损伤作用，提示恒定磁场可保护Schwann细胞免受氧自由基的侵害。其具体机制可能与以下几方面有关:①SOD含有Cu2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+等金属离子,它们都是过渡元素,在3?d和4?s亚层都有未配对电子［6］。根据Keilmann［7］理论,磁场能够影响电子自旋状态,造成不同电子自旋态的非热平衡分布,从而影响SOD的活性,进而间接影响自由基反应；②　自由基本身也是顺磁性物质,具有自旋磁矩,会受到磁场的吸引［8］,因此磁场能直接作用于自由基,在磁场对运动电荷的洛仑兹力及磁场对运动电荷的转动力矩作用下,影响自由基参与生理病理活动；③　MDA含量减少的原因［9］可能是磁场保护后SOD活性增加,其清除超氧阴离子自由基的能力加强,大量减少了羟自由基的生成,进而导致MDA含量的减少；脂类过氧化的中间产物如烷自由基、烷氧基、烷过氧基等脂性自由基带有未抵消的电荷和磁矩,受磁场作用后它们的化学反应速度会改变,有可能参与了减少MDA的生成。

    本实验表明H2O2能够诱导Schwann细胞的氧化损伤，而恒定磁场具有显著抑制Schwann细胞的氧化损伤作用，有利于Schwann细胞的存活，从而进一步揭示了恒定磁场促进周围神经再生的作用机理。

【参考文献】
  ［1］ HTJessen KR, Mirsky RTH. Embryonic Schwann cell development: the biology of Schwann cell precursors and early Schwann cells［J］. J Anat, 1997, 191(4):501505.

［2］ Purves T, Middlemas A, Agthong S， et al. A role for mitogenactivated protein kinases in the etiology of diabetic neuropathy［J］. Fasebl J, 2001, 15(13):2?5082?514.

［3］ Kwon D, Chi C, Lee J， et al. Hydrogen peroxide triggers the ex[x]pression of Fas/Fasl in astrocytoma cell lines and augments apoptosis［J］. J Neuroimmunol, 2001, 113(1):19.

［4］ TKugiyama K, Kerns SA, Morrisett JD, et al. Impairment of endotheliumdependent arterial relaxation by lysolecithin in modified lowdensity lipoproteins［J］. Nature, 1990, 344(6?262):160162.

［5］ 李 莉.Caspase与细胞凋亡［J］.辽宁医学杂志, 2004, 18(3):4244.

［6］ 付 妍, 李晓林, 吕遐龄,等. 恒定磁场对小鼠肝组织超氧化物歧化酶活力及过氧化脂质水平的影响［J］.中国医学物理学杂志, 1998, 15(3):1718.

［7］ Keilmann F. Tripletselective chemistry: a possible cause of biological microwave sensitivity［J］. Z Naturforsch, 1986, 41(12):795798.

［8］ 赵大源,付 研,李红丽,等.磁场的穴位刺激对家兔自由基代谢的影响［J］.中国医学物理学杂志, 2000,17(1):5960.

［9］ 闫秀英,韩丽莎,许志华,等. 旋磁场对血清SOD活力铜蓝蛋白活性及MDA含量的影响［J］.中华物理医学杂志,1997,19(2):115116.