急性髓细胞性白血病病人ＴＣＲζ链基因表达特点

【摘要】  　　目的 建立实时定量ＰＣＲ方法检测ＴＣＲζ链表达水平的方法，了解急性髓细胞性白血病病人外周血ＴＣＲζ链基因表达水平。方法 采用ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ荧光定量ＰＣＲ和相对定量分析法检测３１例急性髓细胞性白血病患者（Ｍ１型６例，Ｍ２型１５例， Ｍ３型１０例）和３０例正常人外周血的单个核细胞的ＴＣＲζ链表达情况，以β２微球蛋白基因（β２Ｍ）作为内参，根据相对定量公式２－△△Ｃｔ计算急性髓细胞性白血病患者与正常人ＴＣＲζ链表达差异倍数。结果 与正常人相比，急性髓细胞性白血病患者ＴＣＲζ链表达特点可以分为表达缺失（１６％）、表达下降（２６％）和表达上升（５８％）三种情况。而三种不同亚型急性髓细胞性白血病之间的ＴＣＲζ链表达模式相似。结论 本研究成功建立了ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ荧光实时定量ＰＣＲ和相关定量分析ＴＣＲζ链表达水平技术，并首先报道了急性髓细胞性白血病病人ＴＣＲζ链表达水平的变化。

【关键词】  ＴＣＲζ链 实时定量ＰＣＲ 急性髓细胞性白血病

　　Ｔｈｅ Ｆｅａｔｕｒｅ ｏｆ ＴＣＲ，Ｚｅｔａ Ｃｈａｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ
ｗｉｔｈ Ａｃｕｔｅ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ

　　ＣＨＥＮ Ｓｉ， ＬＩ Ｙａｎｇ-ｑｉｕ， ＣＨＥＮ Ｓｈａｏ-ｈｕａ， ＹＡＮＧ Ｌｉ-ｊｉａｎ， ＷＵ Ｘｉｕ-ｌｉ， ＣＥＮ Ｄｏｎｇ-ｚｈｉ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｊｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６３２， Ｃｈｉｎａ）

　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｒｅａｌ，ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｙ ｏｆ ＴＣＲζ ｃｈａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ＴＣＲζ ｃｈａｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ （ＡＭＬ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｒｅａｌ，ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＴＣＲζ ｃｈａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ３１ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＡＭＬ ［ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ６ ｃａｓｅｓ ｗｉｔｈ ＡＭＬ，Ｍ１ ｓｕｂｔｙｐｅ （Ｍ１）， １５ ｃａｓｅｓ ｗｉｔｈ Ｍ２， １０ ｃａｓｅｓ ｗｉｔｈ Ｍ３］ ａｎｄ ３０ ｎｏｒｍａｌ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ． β２，ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅ （β２Ｍ） ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ． Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ＴＣＲζ ｃｈａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ２－△△Ｃｔ ｍｅｔｈｏｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＡＭＬ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｇｒｏｕｐｓ， ｔｈｅ ｆｅａｔｕｒｅ ｏｆ ＴＣＲζ ｃｈａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ３ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ ｗｉｔｈ ａｂｓｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ （１６％）， ｄｏｗｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ （２６％） ａｎｄ ｏｖｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ （５８％） ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｓｉｍｉｌａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ＴＣＲζ ｃｈａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ３ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ ＡＭＬ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｈｅ ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ ｒｅａｌ，ｔｉｍｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＣＲζ ｃｈａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ． Ｔｈｉｓ ｉｓ， ｔｏ ｏｕｒ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ， ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｅａｔｕｒｅ ｏｆ ＴＣＲζ ｃｈａｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ＡＭＬ．

　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＴＣＲζ ｃｈａｉｎ； ｒｅａｌ，ｔｉｍｅ ＰＣＲ； ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ

　　Ｔ 细胞免疫功能缺陷是多数血液肿瘤发生和发展的重要原因之一。近年来，比较全面分析病人Ｔ细胞免疫功能变化所采用的指标包括Ｔ细胞受体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＴＣＲ） 基因谱系和胸腺近期输出功能等研究，而对ＴＣＲ信号传导相关分子在病人细胞免疫功能缺陷中的作用的研究则是近期更进一步的工作［１］。本研究在已分析急性髓细胞性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ，ＡＭＬ）病人中存在Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）Ｖβ亚家族Ｔ细胞的表达缺失和胸腺近期输出功能明显降低的基础上［２，３］，为进一步了解病人Ｔ细胞活化和增殖信号通路中相关的变化，首先开展了对在ＴＣＲ，ＣＤ３复合物跨膜信号传递为重要的分子ＴＣＲζ链基因的定量分析，以期进一步明确ＡＭＬ病人中Ｔ细胞免疫功能缺陷的原因。

　　１  材料与方法

　　１．１  标本

经细胞形态学、细胞化学和免疫学确诊的ＡＭＬ病人３１例，包括Ｍ１型６例，Ｍ２型１５例，Ｍ３型１０例。其中男１９例，女１２例，年龄１５～７３岁，中位年龄４１岁。收集肝素抗凝外周血标本，分离单个核细胞，按常规方法进行。同时，３０例正常人外周血样本作为对照，其中男２０例，女１０例，年龄２５～５７岁，中位年龄３０岁。

　　１．２  ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ合成

　　应用ＴＲＩｚｏｌ试剂盒（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）按常规方法提取ＲＮＡ。然后应用随机引物和反转录酶试剂盒（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）合成ｃＤＮＡ第１链，均按常规方法进行。并经β２微球蛋白基因（β２Ｍ）的ＲＴ，ＰＣＲ确定所合成ｃＤＮＡ的质量。

　　１．３  引物设计

　　从ＴＣＲζ链基因序列中设计引物（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．Ｊ０４１３２）［４］，ＴＣＲζ链上游引物：５′，ＧＣＣ ＡＧＡ ＡＣＣ ＡＧＣ ＴＣＴ ＡＴＡ ＡＣ，３′（２７４～２９３ ｂｐ），下游引物：５′，ＴＡＧ ＧＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＴＣ ＴＴＡ ＴＣ，３′（４５８～４３９ ｂｐ），扩增目的片段长度１６６ ｂｐ。β２Ｍ上游引物：５′，ＴＡＣ ＡＣＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＣＣ ＣＣＣ ＡＣ，３′，下游引物：５′，ＣＡＴ ＣＣＡ ＡＴＣ ＣＡＡ ＡＴＧ ＣＧＧ ＣＡ，３′，扩增目的片段长度１４５ ｂｐ。由上海生工合成。

１．４  扩增效率一致性检测

　　利用相对定量法检测不同类型的ＡＭＬ患者与正常人ＴＣＲζ链表达情况之前，首先必须保证ＴＣＲζ链和看家基因β２Ｍ的扩增效率的一致。故将Ｊｕｒｋａｔ细胞株的ｃＤＮＡ以１０倍倍比稀释，以１００～１０－６做为模板，进行ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ实时定量ＰＣＲ来检测其扩增效率是否一致。

１．５  ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ实时定量ＰＣＲ

　　利用ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ染料检测各型ＡＭＬ患者和正常人的ＴＣＲζ链基因表达情况，并将β２Ｍ基因作为内参照。每一标本分别进行ＴＣＲζ链和β２Ｍ 检测。总反应体积为２５ μＬ，应用Ｒｅａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 试剂盒（Ｔｉａｎｇｅｎ，北京），包括２．５?鄢ＲｅａｌＭａｓｔｒＭｉｘ １１．２５ μＬ、０．４ ｍｍｏｌ／Ｌ上、下游引物以及１ μＬ ｃＤＮＡ。在９５ ℃、２ ｍｉｎ变性后，共进行４５个循环扩增，每一循环包括９５℃、１５ ｓｅｃ，６０℃、１ ｍｉｎ，８２℃、１ ｓｅｃ。并在８２℃和８３℃两次读板（１ ｓｅｃ）。随后，以０．１７℃／ｓｅｃ变化速度从５５ ℃到９５ ℃每隔２秒钟记录一次荧光值，获得熔解曲线。反应在ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎ ２ 荧光定量ＰＣＲ仪（ＢＩＯ，ＲＡＤ，ＵＳＡ）中进行。

１．６ 　ＰＣＲ产物分析

　　将所扩增的ＰＣＲ产物熔解曲线分析，同时随机进行２％琼脂糖凝胶电泳，以确定产物是否为所扩增的目的片段，部分ＰＣＲ产物进行核苷酸序列分析，并与基因库所报道的ＴＣＲζ链ｃＤＮＡ序列进行比对。

１．７  ＴＣＲζ链的相对定量分析
　　根据Ｌｉｖａｋ等报道的方法，采用相对定量法分别分析ＡＭＬ患者和正常人ＴＣＲζ链表达水平的差异［５］。以β２Ｍ为内参照，利用Ｃｔ 值，计算ＡＭＬ病人和正常人ＴＣＲζ链的相对量。相对定量公式：２－△△Ｃｔ，其中△△Ｃｔ＝△Ｃｔ（ＡＭＬ患者）－△Ｃｔ（正常人），△Ｃｔ＝Ｃｔ（ＺＥＴＡ）－Ｃｔ（β２Ｍ），而基因差异表达的倍数即为２－△△Ｃｔ 。

１．８  统计学分析
　
　　利用ＳＰＳＳ１１．５进行ＡＭＬ病人ＴＣＲζ链表达情况与年龄的相关性分析。

２  结  果

２．１  扩增效率一致性分析

　　以Ｊｕｒｋａｔ细胞株ｃＤＮＡ的对数值作为横坐标，△Ｃｔ（Ｃｔ（ＺＥＴＡ）－Ｃｔ（β２Ｍ））作为纵坐标。得出直线的斜率为０．０１５，Ｒ＝０．１７９，说明ＴＣＲζ链和β２Ｍ的扩增效率一致。可以利用公式２－△△Ｃｔ进行本试验的结果分析。

２．２  ＰＣＲ产物的确定分析

　　无论是ＡＭＬ患者还是正常人，β２Ｍ产物的熔解曲线峰值均在８３℃。正常人ＴＣＲζ链产物的熔解曲线峰值在８５℃，而ＡＭＬ患者ＴＣＲζ链产物的熔解曲线则会出现多个不同宽大的峰（见图１、图２）。并经随机标本的β２Ｍ和ＴＣＲζ链２％琼脂糖凝胶电泳分析显示ＰＣＲ产物片段大小正确，分别为１４５ ｂｐ和１６６ ｂｐ。ＰＣＲ产物直接序列分析结果与ＴＣＲζ链基因序列（Ｎｏ． Ｊ０４１３２）完全一致。

２．３  ＴＣＲζ链在急性髓细胞性白血病患者中的表达情况

　　根据实时定量ＰＣＲ的相对定量公式２－△△Ｃｔ，与正常人相比，３１例ＡＭＬ患者中有５例（１６％）出现ＴＣＲζ链的不表达，８例（２６％）出现ＴＣＲζ链的表达下降，下降倍数为０．３８±０．２３，１８例患者（５８％）出现ＴＣＲζ链的表达上升，上升倍数为４．９７±６．０４。其中，６例Ｍ１型患者中有２例出现ＴＣＲζ链的表达下降，４例出现ＴＣＲζ链的表达上升；１５例Ｍ２型患者中有２例出现ＴＣＲζ链的不表达，４例出现ＴＣＲζ链的表达下降，９例出现ＴＣＲζ链的表达上升；１０例Ｍ３型患者中有３例出现ＴＣＲζ链的不表达，２例出现ＴＣＲζ链的表达下降，５例出现ＴＣＲζ链的表达上升，具体的升高和降低倍数详见表１。
２．４  ＴＣＲζ链表达情况与年龄的相关性分析

　　利用ＳＰＳＳ１１．５进行ＴＣＲζ链表达情况与年龄的相关性分析结果显示，上升、下降组ＴＣＲζ链表达情况与年龄均无直线相关关系（Ｐ＝０．４９８、Ｐ＝０．３２３）。

３  讨  论

　　Ｔ细胞的活化和增殖主要通过其表面的ＴＣＲ，ＣＤ３复合物而启动，除了ＴＣＲα和ＴＣＲβ外，该复合物中包含多个亚单位（ＣＤ３，γ、ε、δ、ζ和η），构成了信号传导基序。在这些参与ＴＣＲ信号通路的活动中，ＴＣＲζ链对于跨膜信号传递为重要，而且它与胸腺细胞的选择有关［４］。ＴＣＲζ链表达的下调和缺失不仅影响ＴＣＲ在细胞表面的表达，循环Ｔ细胞的阳性信号的数量，更影响了成熟淋巴细胞的活化水平和增殖反应［１］。近年来国外有报道ＴＣＲζ链在多种人类肿瘤中表达下调或缺失的现象，且发现ＴＣＲζ链表达越低下，肿瘤负荷就越大，免疫细胞功能缺陷就越明显，生存预后也越差［６－８］。

　　本研究在既往对ＡＭＬ病人ＴＣＲ Ｖβ基因谱系分析和胸腺近期输出功能检测的基础上［２，３］，进一步利用实时定量ＰＣＲ和采用相对定量公式比较正常人与病人ＴＣＲζ链基因表达特点，结果发现在不同类型的ＡＭＬ病人外周血中，ＴＣＲζ链基因的表达水平出现三种不同情况，５例（１６％）出现ＴＣＲζ链的不表达，８例（２６％）出现ＴＣＲζ链的表达下降，１８例患者（５８％）出现ＴＣＲζ链的表达上升，且三种类型的ＡＭＬ病人ＴＣＲζ链下降、上升所占的比例基本相同。该结果与已报道的在其它肿瘤病人中所发现的全部病人出现ＴＣＲζ链表达低下情况有所不同［４］，可能的几种原因是：（１）所分析的肿瘤类型不同；（２）所采用的分析方法不同，因所报道的研究多数采用ＲＴ，ＰＣＲ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ或ＦＡＣｓ等方法，而并非应用实时定量ＰＣＲ方法；（３）由于ＴＣＲ，ＣＤ３复合物中存在着多个ＣＤ３的亚单位，其它基因的表达异常也可能引起相应的变化，故该研究结果提示在ＴＣＲζ链基因分析的基础上，进一步分析其他相关基因的表达情况有可能得出更为全面的结果。

　　总之，本研究采用ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ染料和实时定量ＰＣＲ来建立检测ＴＣＲζ链基因表达水平的方法，并利用相对定量公式２－△△Ｃｔ来进行基因差异表达的比较，此方法可以更为客观地反应基因表达水平的差异情况，后者是国外研究人员比较的方法，检测了不同类型ＡＭＬ病人及正常人的ＴＣＲζ链基因表达水平的特点，本研究首先提供了初发未治ＡＭＬ病人的ＴＣＲζ链基因表达特点，该研究将进一步动态追踪治疗过程中和缓解期病人的ＴＣＲζ链基因表达特点，从而为ＡＭＬ病人细胞免疫情况提供了更全面的新资料。并期望为利用该指标作为评价病人Ｔ细胞免疫功能及其与疗效和预后的一些相关关系提供研究的条件。

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作者：陈思 李扬秋 陈少华 杨力建 吴秀丽 岑东芝

作者单位：510632 暨南大学医学院血液病研究所， 广州