钒化钠对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株增殖影响的研究

【关键词】  钒化钠 NIH3T3细胞 增殖

    Effect of sodium vanadate on the proliferation of NIH3T3 cell line

    LV Jun1，JIA Pingping1，SU Yan1，2，ZHOU  Lishe1，2，HUANG  Lihua1，SHAO  Guo1，2，3 ，YAN  Shaochun1

    (1. Biomedical Research Center, Baotou Medical College, Baotou 014010, China;

    2. Dept. of Molecular Biology and Biochemistry, Baotou Medical College,  Baotou  014010, China;

    3. Central Laboratory, Medical College of Shantou University, Shantou  515041, China)

    Abstract: ob[x]jective: To study the effects of sodium vanadate（SV） on the proliferation of NIH3T3 cell line at different concentration and duration. Methods: The cells were treated with different concentrations of SV and the proliferation of cells was detected by the method of MTT assay  for different durations. Results: 0.1 μM of SC had no effect on proliferation of NIH3T3, 1.010.0μM of SC enhanced the proliferation and 200 μM of SC  promoted apoptosis,100 μM of SC had different effects for different druations.Conclusion: The exposure of NIH3T3 cells to SV leads to the proliferation or apoptosis depending on the doseand time.

    Key words:vanadates; NIH3T3 cell; proliferation

    钒以多种价态和形式存在，由于钒酸根与磷酸根结构类似，因此对磷酸根代谢酶有抑制或促进作用［1］。其中蛋白酪氨酸磷酸酶（phosphotyrosine phosphatases，PTP）受到其抑制，PTP在体内的功能主要是使酪氨酸激酶脱磷酸，而酪氨酸激酶在细胞生长、分化、死亡和信号转导等过程中起到重要作用，因此钒化物可以调节细胞的增殖等生命过程。本研究使用小鼠成纤维NIH3T3细胞，研究SV促生长分裂或程序化死亡的不同剂量及作用时间，以丰富人们对SV促进细胞增殖作用的认识。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  细胞株  小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株，购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。

    1.1.2  主要试剂  DMEM培养基（Gibico公司），胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司），胰蛋白酶（上海华美生物工程公司），台盼兰（上海华美生物工程公司 ），二甲基亚砜（Amersco），MTT（Amersco），其他试剂为分析纯。

    1.1.3  主要仪器  二氧化碳培养箱（Thermoforma of THE U.S.A），倒置相差显微镜（XDB1B，国产），超净工作台（SWCJ2F，上海博迅），自动双重纯水蒸馏器（SZ98，上海本波仪器有限公司），手提式压力蒸汽消毒器（YXQ02型，山东），电热恒温鼓风干燥箱（Gzxdh.500bs，上海），电子天平（FA1004，上海恒平科学仪器公司），全自动酶标仪（ELX800 of THE USA）。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养  小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞株在37 ℃、饱和湿度及5％CO2条件下，用培养瓶在含10％胎牛血清，100 μ／ml青链霉素的DMEM培养液中传代培养。

    1.2.2  细胞增殖实验  采用噻唑蓝（MTT）比色法测定NIH3T3细胞的增殖情况。将单层NIH3T3细胞消化,倾去消化液后用含10%胎牛血清的DMEM 配制成5×104个细胞/ ml 的悬液,在96 孔细胞培养板中每孔接种0.2 ml。在5%CO2、饱和湿度条件下、37 ℃培养24 h 后吸弃培养液,分别加入含终浓度为0.1 、1.0 、5.0 、10.0 、100.0 、200.0 μM SV的DMEM 培养液,各浓度均重复6孔。在上述培养条件下分别培养4 h、6 h、8 h、12 h、18 h、24 h后,加入MTT试剂，测定490 nm 的吸光率(MTT 测定值) 。实验中同时设置不含SV的对照组,其重复孔数、温度和湿度条件、时间等均与实验组相同。

    1.3  统计学处理

    采用SPSS12.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析,统计数据以均数±标准差（±s）表示,P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    如表1、图1所示，0.1 μM SV对细胞的增殖没有作用，而低于100 μM SV可以促进细胞增殖，200 μM SV则可以抑制细胞增殖，且4 h、6 h、8 h、12 h、18 h、24 h的结果趋势基本一致。而100 μM SV 8 h内可以促进NIH3T3细胞增殖，12 h以上抑制细胞增殖。结果提示低浓度SV可以促进细胞增殖，而高浓度SV抑制细胞增殖，且其作用有时间依赖性。表1  小鼠成纤维NIH3T3细胞在不同浓度的钒化钠作用4 h、6 h、8 h、12 h、18 h、24 h后测定的MTT值

    3  讨  论

    钒是化学元素周期表中VB族的过渡元素，广泛存在于自然界中，是人体必需的微量元素，参与人体许多不同的生理过程,如细胞的生长和分化、糖类及脂类的代谢等［2］。有研究［3］结果显示，钒还有抗肿瘤的作用，钒酸盐有促进人乳腺癌细胞（MCF7）凋亡的作用，并且有剂量依赖性。由此看出，钒既有促进细胞增殖的作用又有促进其凋亡的作用，本实验采用MTT比色法检测钒酸盐对NIH 3T3细胞株的影响。

    MTT 比色法是反映细胞增殖常用的方法。MTT能被活细胞线粒体中的琥珀酸还原酶还原为蓝紫色结晶,其490 nm的A 值(MTT 测定值)与活细胞的数目成正比。本实验结果显示,0.1 μmol/L SV组的MTT 测定值与对照组比较无统计学意义，说明这一浓度对NIH3T3细胞株增殖作用影响不大；1.0、5.0、10.0 μmol/ L 的SV组均可使小鼠成纤维NIH3T3细胞 MTT 测定值明显增加,并且随SV浓度的增加，MTT 测定值也增加，提示在这一浓度范围内，SV有促进NIH3T3细胞增殖的作用，10.0 μmol/ L 的SV组作用为明显。Etcheverry等［4］报道，低于10 μM的SV和过氧钒化钠都有效地促进成纤维细胞生长，与我们的实验结论基本一致。200.0 μmol/L SV组的MTT 测定值较对照组明显降低,表明高浓度SV可促进小鼠成纤维NIH3T3细胞的凋亡。据报道，在C3H10T1/2细胞中，200 μM SV对细胞已构成毒性作用［5］，这是本实验设定上限浓度的依据，我们的实验结果也与此相吻合。我们的实验结果显示：100 μM SV作用4 h后，其MTT 测定值降低，表明在此时间范围内，100 μM SV可促进小鼠成纤维NIH3T3细胞的凋亡；100 μM SV作用6 h、8 h后，其MTT 测定值与对照组比较均升高，而100 μM SV作用12 h、18 h后其MTT 测定值变化不明显；当作用时间达到24 h后，其MTT 测定值较对照组明显降低，提示100 μM SV对细胞作用随处理时间不同而不同。我们推测这一浓度可能是SV对小鼠成纤维NIH3T3细胞双重作用的临界浓度。且不同浓度SV作用4 h、6 h、8 h、12 h、18 h、24 h的结果趋势基本一致，此结果与Salice 等［6］的报道基本一致，低浓度的SV可促进小鼠成纤维NIH3T3细胞的增殖, 高浓度时则表现为增殖抑制作用,且随着SV作用时间的延长，这种趋势依然存在，提示在一定的作用时间范围内SV对小鼠成纤维NIH3T3细胞促增殖和促凋亡的双重作用与药物浓度有关。

    综上所述，低浓度的SV可促进小鼠成纤维NIH3T3细胞的增殖, 高浓度时则表现为增殖抑制作用,为后续研究细胞信号传导奠定基础，也为治疗肿瘤和糖尿病提供理论依据。

【参考文献】
  ［1］ G Huyer, S Liu, J Kelly, et al. Mechanism of inhibition of proteintyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate［J］. The Journal of Biological Chemistry，1997,(272):843851.

［2］ Stern A, Yin X, Tsang SS, et al. Vanadium as a modulator of cellular regulatory cascades and oncogene ex[x]pression［J］. Biochem Cell Biol, 1993, 71:103112.

［3］ Ray RS, Rana B, Swami B, et al. Vanadium mediated apoptosis and cell cycle arrest in MCF7 cell line［J］.Chem Biol Interract,2006,163(3):239247.

［4］ Etcheverry SB, Crans DC, Cortizo AM, et al. Insulinmimetic action of vanadium compounds on osteoblastlike cells in culture［J］. Arch Biochem Biophys,1997,338(1):714.

［5］ Yan S, Wenner CE. Modulation of cyclin D1 and its signaling components by the phorbol ester TPA and the tyrosine phosphatase inhibitor vanadate［J］. J Cell Physiol, 2001 ,186(3):33849.

［6］ Salice VC, Cortizo AM, Gomez Dumm CL, et al. Tyrosine phosphorylation and morphological transformation induced by four vanadium compounds on MC3T3E1 cells［J］. Mol Cell Biochem , 1999 ,198 :119128.

作者：闫少军

作者单位：包头医学院生物医学研究中心 ，内蒙古 包头 014010