降钙素原抗原的表达及其抗体的制备与初步鉴定

作者：刘琦    作者单位：蛋白质组学国家重点实验室, 北京蛋白质组研究中心, 军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 北京 102206
【摘要】  目的: 构建降钙素原（PCT）原核表达载体, 制备其多克隆抗体（pAb）和单克隆抗体(mAb), 并进行特性鉴定。方法: 以甲状腺癌细胞cDNA文库为模板, 构建重组表达质粒pGEX4T1PCT和PET32aPCT, 在大肠杆菌中分别表达GSTPCT和HisPCT融合蛋白, 用HisPCT免疫家兔和BALB/c小鼠制备兔pAb和鼠mAb。通过ELISA法测定抗人PCT抗血清效价; 用Western blot、 间接免疫荧光鉴定pAb的特异性。使用间接ELISA法筛选分泌特异性抗PCT的杂交瘤细胞株, 采用Western blot和间接免疫荧光鉴定mAb的特异性。 结果: 构建了重组表达质粒pGEX4T1PCT和PET32aPCT, 并在大肠杆菌中表达、 纯化。经ELISA法测得抗人PCT抗血清效价是1∶256 000。制备的抗PCT兔多克隆抗体可特异地识别重组和天然的PCT蛋白。获得8株可稳定分泌抗PCT的杂交瘤细胞株, 可识别重组人PCT蛋白, 其中有4株可特异性结合TT细胞质中的天然蛋白。 结论: 成功地制备出兔抗人PCT抗血清和8株抗PCT的mAb, 为进一步研究PCT在严重的细菌感染和脓毒症中的病理及生理作用奠定了基础。

【关键词】  降钙素原 原核表达 抗体制备 鉴定

　　降钙素原（procalcitonin, PCT）来自定位于第11号染色体上（11P15, 4）的单拷贝基因, 该基因由2800个碱基对组成, 含6个外显子和5个内含子, 基因全长Mr约7 600。转录后在甲状腺滤泡旁细胞粗面内质网内翻译成降钙素原前体proprocalcitonin, 包括N端84个氨基酸、 活性降钙素（CT, 32肽）和降钙蛋白（katacalcin, 21肽）三部分, 分别由2肽（LysArg）及4肽（GlyLysLysArg）连接。降钙素原前体在内源多肽酶作用下剪掉nProCT端单一序列, 生成116个氨基酸的PCT。PCT是无激素活性的降钙素前肽物质［1］。在正常情况下, 具有激素活性的降钙素是在甲状腺滤泡旁细胞产生与分泌, 并由细胞内特殊蛋白酶分解PCT成降钙素。正常人血中PCT浓度非常低, 然而在严重的细菌感染和脓毒症时, 在外周血液中发现完整的PCT浓度升高。我们构建了重组表达载体, 获得融合表达蛋白后, 免疫家兔和BALB/c小鼠, 制备抗PCT抗血清和抗PCT的单克隆抗体（mAb）, 并进行特性鉴定, 为进一步研究PCT的功能及其应用提供有力的工具。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  TT细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心; 大肠杆菌BL21感受态菌株为本实验室自制。原核表达载体pGEX4T1和PET32a购自Amersham公司。限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、 ExTaq酶、 T4连接酶等购自TaKaRa公司。PCR回收试剂盒、 质粒提取试剂盒购自Omega公司。BALB/c小鼠和大耳白兔子（2～2.5 kg, 雄性）购自军事医学科学院动物中心。小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0为军事医学科学院放射与辐射医学研究所免疫室制备。鼠抗His标签mAb、 HRP羊抗鼠IgG、 HRP羊抗兔IgG、 FITC羊抗鼠IgG、 ECL显色系统均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  PCT抗原的制备和纯化  根据Human Protein Reference Databa[x]se中提供的PCT的氨基酸序列, 并结合应用生物信息学软件DNAstar的表位分析, 以GenBank发表的核酸序列为准, 综合设计引物。在其上游引物设计EcoRⅠ酶切位点, 下游引物设计XhoⅠ酶切位点, 片段长度270个碱基（PCT的27～116位氨基酸）, 从TT细胞提取总RNA, 反转录合成cDNA, 以cDNA为模板扩增目的片段。回收的目的片段、 pGEX4T1和PET32a载体经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后, 分别进行连接, 转化大肠杆菌, 阳性克隆经测序正确后抽提质粒, 进行诱导表达。PCT在BL21细菌中以可溶性形式表达, 表达后用亲和层析法进行了纯化。

　　1.2.2  HisPCT融合蛋白的Western blot分析  将重组蛋白经常规SDSPAGE凝胶电泳后将蛋白质转移至PVDF膜上, 封闭液封闭后, 加入鼠抗His mAb与膜上的蛋白进行抗原抗体反应后, 用HRP羊抗鼠IgG进行检测, ECL显色, 至目的条带染色清晰时终止反应。

　　1.2.3  兔抗人PCT抗血清的制备  将纯化的PCT融合蛋白和等体积弗氏完全佐剂充分混合后, 每只家兔皮下多点注射融合蛋白800 μg; 初次免疫4周后加强免疫1次, 接下来1周后耳缘静脉采血检测抗体效价。2周后颈动脉采血, 分离血清, 分装后置-20℃保存。

　　1.2.4  兔抗PCT血清的特性鉴定  （1）ELISA检测抗血清效价: ELISA检测板用GSTPCT融合蛋白以0.1 mg/L的浓度包被。按梯度稀释抗血清, 每孔加入100 μL（阴性对照为正常兔血清, 空白对照为二抗稀释液）, 37℃孵育30 min洗涤3次后, 加入1∶10 000稀释的HRP羊抗兔IgG, 37℃孵育30 min洗涤3次后进行TMB显色。（2）Western blot检测PCT融合蛋白: 重组蛋白经SDSPAGE凝胶电泳后, 将蛋白质转移至PVDF膜上, 封闭液封闭后, 加入兔抗人PCT血清与膜上的蛋白进行抗原抗体反应后, 用HRP羊抗兔IgG进行检测, ECL显色, 至目的条带染色清晰时终止反应。（3）间接免疫荧光检测: 当TT细胞长到1×106/瓶时铺6孔板, 培养72 h后, 40 g/L多聚甲醛（10 g/L Triton）固定10 min; 空气干燥5 min; PBS清洗标本3次, 各2 min; 羊血清（用1×PBS按1∶10稀释）在37℃封闭30 min; 滴加兔抗人PCT抗血清, 4℃过夜; PBS清洗标本3次, 吹干; 滴加1∶200稀释的FITC羊抗兔IgG, 室温孵育30 min; PBS洗3次; 加染核试剂Hochest（用1×PBS按1∶5 000稀释）, 室温孵育30 min, PBS洗3次; 800 mL/L甘油封片, 镜检拍照。

　　1.2.5  鼠mAb的制备  3只6～8周龄, 体质量为17～21 g的BALB/c小鼠。免疫时, 每只小鼠分别经皮下多点注射接种HisPCT 80 μg, 加等体积弗氏完全佐剂。首免4周后进行第2次免疫, 每只小鼠分别经皮下多点注射接种HisPCT 40 μg, 加等体积弗氏不完全佐剂。第2次免疫后7 d, 经尾静脉采血, 用ELISA法测定血清抗体的效价。选择抗体效价高的小鼠, 于融合前4 d, 在尾静脉注射HisPCT 40  μg/只, 加强免疫1次。取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0细胞按常规方法融合。用间接ELISA法筛选, 有限稀释法克隆化, 并按常规方法制备mAb腹水。

　　1.2.6  抗PCT mAb的特性鉴定  （1）mAb的腹水效价及Ig亚类的测定: 腹水中mAb的效价采用间接ELISA法测定。采用Hbt小鼠mAb分型试剂盒测定杂交瘤细胞培养上清中抗PCT mAb的Ig亚类。（2）mAb的特异性鉴定: Western blot检测, 将纯化后GSTPCT和HisPCT加入还原性SDSPAGE上样缓冲液中, 于100℃变性10 min。取重组蛋白进行SDSPAGE, 并转至PVDF膜, 封闭, 依次滴加杂交瘤细胞的培养上清及HRP羊抗鼠IgG, ECL显色后观察结果。间接免疫荧光检测, 用杂交瘤细胞上清为一抗检测PCT在TT细胞中的表达, 具体实验方法同1.2.4。

　　2  结果

　　2.1  HisPCT融合蛋白的表达与鉴定  SDSPAGE电泳检测, 观察到含重组质粒pGEX4T1PCT和PET32aPCT的菌经IPTG诱导表达后, 在相对分子质量（Mr）约36 000和29 000处均出现1条蛋白带, 其大小与预测的PCT融合蛋白的Mr相一致, 融合蛋白主要以可溶性形式表达, 经纯化后蛋白纯度可达到90%（图1）。通过Western blot检测, 应用抗His的抗体能够在相应位置检测到His和HisPCT融合蛋白（图2）。

　　图1  PCT融合蛋白的SDSPAGE分析（略）

　　Fig 1  SDSPAGE analysis of PCT fusion protein

　　M: Protein marker; 1: Purified GSTPCT fusion protein; 2: Purified HisPCT fusion protein.

　　2.2  兔抗PCT抗血清的特性鉴定  （1）ELISA检测板用GSTPCT融合蛋白以1 mg/L的浓度包被。间接法检测抗体的效价为1∶256 000。用兔抗PCT抗血清对融合蛋白进行Western blot实验, 证实在Mr约29 000和36 000处各有一特异性的条带, 说明表达的PCT蛋白具有较好的免疫学活性。阳性对照（pET32a代替抗原）在相应位置出现Mr为19 000的阳性条带, 阴性对照（兔免疫前血清代替一抗）在相应位置无条带（图2）。（2）间接免疫荧光检测: 将TT细胞铺6孔板, 培养72 h后, 滴加兔抗PCT抗血清, 4℃过夜后, 加FITC羊抗兔IgG, 在荧光显微镜下观察, 兔抗PCT抗血清与TT细胞质中的天然PCT有阳性反应, 呈现明显的绿色荧光。

　　图2  兔抗PCT抗血清特异性的Western blot鉴定（略）

　　Fig 2  Characterization of specificity of rabbit  antiserum against PCT by Western blot

　　M: pET32a vector from E.coli BL21;  1: HisPCT fusion protein expressed in E.coli BL21;  2: GSTPCT fusion protein expressed in E.coli BL21;  3: Lysate of E.coli BL21.

　　2.3  杂交瘤的细胞株的建立及Ig亚类的测定  （1）经细胞融合, 筛选及克隆化, 获得8株能稳定分泌抗PCT mAb的杂交瘤细胞株（GDE034、 GFH093、 GCE115、 GAG102、 GAB113、 GAF01、 GBA058、 GGH108）。（2）Ig亚类的测定结果显示, mAb均为IgG1亚类。

　　2.4  mAb的特异性鉴定  （1）Western blot显示, 杂交瘤GDE034、 GFH093、 GCE115、 GAG102、 GAB113、 GAF01、 GBA058、 GGH108的培养上清能同时检测到GSTPCT和HisPCT（图3）, 表明这8株mAb可特异的识别PCT。（2）间接免疫荧光检测: 将TT细胞铺6孔板, 培养72 h后, 依次滴加杂交瘤细胞的培养上清, 4℃过夜后, 加FITC羊抗鼠IgG, 在荧光显微镜下观察, 其中4株杂交瘤GDE034、 GFH093、 GCE115、 GGH108的培养上清与TT细胞质中的天然PCT有阳性反应。

　　图3  抗PCT mAb GGH108特异性的Western blot鉴定（略）

　　Fig 3  Characterization of antiPCT mAb specificity by Western blot

　　M: Lysate of  E.coli BL21; 1: HisPCT fusion protein expressed in  E.coli BL21; 2: GSTPCT fusion protein expressed in E.coli BL21.

　　3  讨论
   
　　已证实PCT是一项有用的实验室指标［2］, 同其他实验室指标CRP、 TNFα、 IL6、 IL8和IL10相比, PCT对严重的细菌感染和脓毒症的早期诊断具有高的灵敏性和特异性［3］, 更有利于跟踪这些情况的临床过程。诱发PCT产生的主要原因是机体对细菌内毒素的反应, 病毒性疾病、 自身免疫病、 肿瘤、 体内器官的细菌感染并不诱发PCT产生, 因此PCT可用于鉴别诊断细菌性和非细菌性疾病, 进而用于临床鉴别诊断。在脓毒症患者PCT浓度通常是在10～100 μg/L之间或更高。当治疗后, PCT浓度将以其半衰期为20～24 h的速度降低至正常范围(<0.5 μg/L）。因此, 对PCT浓度的检测可对临床威胁生命的感染过程做出监测, 同时有助于医生制定有效的治疗方案, 并终控制细菌感染。对于混合重症监护病房（ICU）患者的临床研究发现［4］, PCT是能够作为一个选择性指标鉴别诊断是否患有脓毒症, 将其与系统性炎症反应综合症（SIRS）区分开［5］, 并被证实为好的辅助指标。事实上, PCT不仅是一实验指标, 更重要是能够监测脓毒症临床过程。临床试验研究证实, 通过PCT对脓毒症患者诊断和治疗过程的监测, 为抢救患者提供了宝贵的时间, 可以减少不必要抗生素的使用, 缩短住院天数, 从而降低患者总体治疗费用, 降低了资源浪费的同时可快速明确病原学诊断, 提高治疗效果。

【参考文献】
  　　［1］ Snider RH Jr, Nylen ES, Becker KL. Procalcitonin and its component peptides in systemic inflammation: immunochemica1 characterization［J］. J lnvestig Med, 1997, 45(9): 552-560.

　　［2］ Carrol ED, Thomson AP, Hart CA. Procalcitonin as a marker of sepsis［J］. Int J Antimicrob Agents, 2002, 20(1): 1-9.

　　［3］ Heper Y, Akalin EH, Mistik R, et al. Evaluation of serum Creactive protein, procalcitonin, tumor necrosis factor alpha, and interleukin10 levels as diagnostic and prognostic parameters in patients with communityacquired sepsis, severe sepsis, and septic shock［J］. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2006, 25(8): 481-491.

　　［4］ Dorizzi RM, Polati E, Sette P, et al. Procalcitonin in the diagnosis of inflammation in intensive care units［J］. Clin Biochem, 2006, 39(12): 1138-1143.

　　［5］ Hryckiewicz K, Juszczyk J, Samet A, et al. Procalcitonin as a diagnostic marker in systemic inflammatory response syndrome (SIRS) and sepsis［J］. Przegl Epidemiol, 2006, 60(1): 7-15.