急性白血病患者SHP-1与c-kit基因表达及其临床意义

作者：韩颖,罗建民,贾晓辉,王福旭,姚丽,杜行　　作者单位：河北医科大学第二医院血液科，石家庄050000;基金项目：河北省自然科学基金资助项目，编号C2005000744

　　【摘要】为了探讨造血细胞磷酸酶(SHP-1)基因和原癌基因c-kit在急性白血病(AL)患者中的表达及其与AL的发生及预后的关系，应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测60例急性白血病患者及33名正常对照者单个核细胞的SHP-1、c-kit mRNA的表达。结果显示：SHP-1在AML细胞中表达阳性率由高至低依次为缓解组、初治组、复发组，c-kit表达阳性率则相反，各组与正常对照组相比有显著性差异(P<0.05)，SHP-1在AML细胞中表达阳性率比ALL细胞高，有显著性差异(P<0.05)，c-kit在AML细胞中表达阳性率比ALL细胞中高，有显著性差异(P<0.05);SHP-1与c-kit表达成负相关(r=-0.502，P<0.05);30例初治AML患者SHP-1+与SHP-1-的完全缓解率均有显著性差异(P<0.05)，c-kit+与c-kit-的完全缓解率均有显著性差异(P<0.05)。结论：SHP-1可能是一个潜在的抑癌基因，它负性调节c-kit基因而抑制肿瘤的发生，同时监测二者的表达可作为判断AL治疗转归的预测指标。

　　【关键词】 急性白血病; SHP-1; c-kit; 聚合酶链反应

　　AbstractThe aim of study is to investigate the ex[x]pression of hematopoietic cell phosphatase (SHP-1) gene and c-kit pro-oncogene in acute leukemia(AL) and its impact on prognosis in AL. Semi-quantity reverse transc[x]riptase-polymerase chain reaction(RT-PCR) was used to detect the ex[x]pression of SHP-1 mRNA and c-kit mRNA in 60 AL patients and 33 normal controls(NC). The results showed that the positive rates of SHP-1 ex[x]pression from high to low level were found orderly in complete remission group, newly diagnosed group and relapsed group, there was significance difference between each group and NC group(P<0.05). The positive rates of c-kit ex[x]pression were opposite order in each groups as compared with SHP-1. there was also significance difference between each group and NC group(P<0.05). The positive rate of SHP-1 and c-kit ex[x]pressions in AML was higher than that in ALL(P<0.05), there was nagative correlation between ex[x]pressions of SHP-1 and c-kit (r=-0.502，P<0.05); The difference between the complete remission rate in SHP-1 positive and in SHP-1 negative patients from 30 newly diagnosed AML patients was significant (P<005), the same result was found between c-kit+ complete remission and c-kit- complete remission. It is concluded that SHP-1 gene is a potentially anti-oncogene and inhibits the growing of tumor by negatively modulating c-kit gene. Simultaneous detection of SHP-1 and c-kit gene may act as a factor for predicting prognosis in AL.

　　Key wordsacute leukemia; SHP-1; c-kit; polymerase chain reaction

　　SHP-1为含SH2域(src homology-2 domain)的酪氨酸磷酸酶-1，主要表达于造血细胞，因此又称为造血细胞磷酸酶(hematopoietic cell phosphatase，HCP，也称为SHP-1或SHPTP1)。SHP-1在造血细胞生成中的作用已经由SHP-1突变的motheaten小鼠所证实，在此模型中由于剪切突变从而影响SHP-1基因的SH2或PTP结构域，进而导致SHP-1的磷酸酶活性部分或全部缺失，在motheaten小鼠(me)和viable motheaten小鼠(mev)引起包括骨髓粒-单核细胞的过度增殖与积聚的多种造血功能异常，强烈提示motheaten小鼠是由于丧失了SHP-1功能所致。c-kit原癌基因是酪氨酸激酶受体家族Ⅲ类的一个重要成员[1]。c-kit与其配体干细胞生长因子(SCF)相结合对造血干细胞及祖细胞起支持作用，随着细胞的分化成熟，逐渐从细胞表面消失。

　　c-kit与 SCF 结合后和 SHP-1 偶联发生去磷酸化的细胞内反应，从而失去SHP-1的负性调控作用。为了评价SHP-1和c-kit基因在急性白血病(AL)发病中的作用，我们采用RT-PCR的方法检测了60例AL患者和33例健康人骨髓标本中SHP-1和c-kit基因的表达情况。

　　材料和方法

　　研究对象

　　60例AL系我院2004年3月至2005年1月住院治疗患者，均经细胞形态学、组织化学和免疫表型检测确诊。在60例中急性髓细胞白血病(AML)52例(包括初治组30例，缓解组18例，复发组4例)，急性淋巴细胞白血病(ALL)8例(包括初治组6例，复发组2例)。60例中男33例，女27例，中位年龄34岁(14-70岁)。33名健康志愿者作为正常对照。初治AML(除M3)患者采用标准DA(阿糖胞苷、柔红霉素)方案诱导缓解。复发AML患者采用IA(阿糖胞苷、去甲氧柔红霉素)化疗方案。M3患者采用全反式维甲酸(ATRA)或ATRA与三氧化二砷(As2O3)合用或以ATRA为主联合应用小剂量HA(阿糖胞苷、高三尖杉酯碱)方案治疗。对于ALL患者采用VITP(长春新碱、异环磷酰胺、吡喃阿霉素、泼尼松)方案治疗。

　　细胞分离及总RNA的提取

　　取骨髓2 ml，肝素(107 U/L)抗凝，生理盐水稀释3-4倍，Ficoll淋巴细胞分离液4 ml， 2500×g离心16分钟，分离出单个核细胞，然后用TRI-REAGENT提取细胞总RNA。

　　逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)

　　用随机六聚引物合成cDNA。1 μg总RNA，在20 μl反应体积中， 37℃ 60分钟反转录，95℃ 5分钟终止反应。PCR反应体积25 μl， 含cDNA 1 μl， MgCl2 1.5 mmol/L，200 μl的4种dNTP，0.5 μmol/L的引物， 1.5 U的Taq酶。SHP-1寡核苷酸引物由日本基因研究实验室提供， 序列资料获自GenBank(获取号M27273)，c-kit引物由美国Cybersyn公司合成。SHP-1正义引物： 5′ -GGGCAGGCA GAGACGCT -3′ ;反义引物;5′ -CTTCTTGAAATG CTCCACCA- 3′ 。c-kit正义引物： 5′ -GTGGTTA AAGGAAACGC TCG -3′ ;反义引物： 5′ - CATACA TTTCAGCAGGTGCG-3′ ; GADPH正义引物：5′- CGGGAAGCTTGTCATCAATGG-3′ ; 反义引物：5′- GGCAGTGATGGCATGGACTG-3′ 。SHP-1扩增片段长度为238 bp, c-kit扩增片段长度为232 bp， GADPH扩增片段长度为358 bp。扩增条件为：SHP-1：94℃变性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸60秒， 35个循环，后72℃延伸10分钟; c-kit：95℃变性45秒，50℃退火45秒，72℃延伸60秒， 35个循环，后72℃延伸10分钟;GADPH：94℃变性60秒，60℃退火55秒，72℃延伸60秒， 22个循环，后72℃延伸10分钟。产物分析：取10 μl扩增产物，1 g/100 ml琼脂糖凝胶电泳(90V，40分钟),溴化乙锭染色，紫外透射仪上观察结果并照相。

　　统计学分析

　　应用Excel建库，所有数据均应用SPSS软件处理，两样本均数的比较采用两个独立样本非参数秩和检验，组间率比较行四格表卡方检验。P≤0.05为有统计学意义。

　　结果

　　正常对照、AML患者(其中包括初治组、缓解组、复发组)、ALL患者(其中包括初治组、复发组)SHP-1、c-kit基因表达水平和阳性率，以相应标本中三磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH)作阳性对照，将SHP-1/GADPH≥0.1定为SHP-1基因表达阳性，将c-kit /GADPH≥0.1定为c-kit基因表达阳性。

　　SHP-1表达

　　SHP-1在33例健康人标本中全部表达阳性，SHP-1 mRNA表达水平为2.096(0.134，9.638)。30例初治AML患者SHP-1 的阳性率为30.0%，其表达水平为0(0，0.706)，表达水平与正常对照组比较差别具有显著性(P=0.00);4例复发AML患者SHP-1全部表达阴性，与正常对照组比较差别有显著性(P=0.001)，与初治AML组相比表达水平低，有统计学意义(P=0.016);18例缓解AML患者表达阳性率为61.0%，表达水平为0.156(0，1.262)，与初治AML组比较无统计学意义(P=0.065)。8例ALL患者SHP-1的表达均为阴性，因例数较少缺乏分型比较意义。52例AML患者SHP-1的表达阳性率为38.0%，表达水平为0(0，1.262);8例ALL患者均无SHP-1的阳性表达，两者的表达水平比较结果有显著性差异(P=0.038)。

　　c-kit表达

　　c-kit mRNA在33例正常人中表达阳性率为12.0%，表达水平为0(0，0.211)。初治AML组c-kit mRNA的阳性率为73.3%，表达水平为1.500(0，7.333)，与正常对照组比较有显著性差异(P=0.00)。复发的4例AML患者中c-kit mRNA表达阳性者为4 例，表达水平为3.167(1.778，7.333)，与初治AML组比较无统计学意义(P=0.118)。18例缓解患者c-kit　mRNA的阳性表达率为38.9%和表达水平为0(0，2.816)，与初治AML组比较有统计学意义(P=0.002)。ALL患者因例数较少缺乏分型比较意义。在AML中，c-kit mRNA的阳性率为61.5%，其表达水平为1.299(0，7.333)， ALL中的表达阳性率为12.5%和表达水平为0(0，0.232)，有统计学差异(P=0.007)。

　　SHP-1、c-kit mRNA表达与AL相关性分析

　　AL患者SHP-1、c-kit mRNA表达水平的相关分析发现两者的mRNA水平成负相关(非参数相关分析，r=-0.502，P=0.00)。

　　初治AL患者SHP-1、c-kit表达与疗效的关系

　　根据电泳的结果，将30例初治的AML患者分为SHP-1+/SHP-1-、c-kit+/c-kit-组。SHP-1+组缓解率高于SHP-1-组缓解率，χ2检验差别有显著性(χ2=9.357，P=0.002)。c-kit+组的缓解率低于c-kit-的缓解率，χ2检验差别有显著性(χ2=12.129，P=0.000)。在5例SHP-1+c-kit+双阳性组的缓解率为40%(2/5)，SHP-1-c-kit+组的缓解率为6.7%(1/15),两组之间的缓解率无统计学差异(χ2=2.830，P=0.092)。

　　讨论

　　SHP-1是一个68 kD的胞浆蛋白，在造血细胞发育[2]、增殖和受体介导的促有丝分裂信号转导过程中表达[3]，在一系列促生长受体介导的信号转导中起重要的负调节作用，这些受体包括酪氨酸激酶受体如c-kit、CSF-1、TrkA和EGF受体，细胞因子受体如IL-3、IFN-α/β和EPO受体以及免疫细胞受体如CD22和FcγRⅡB[4]。 SHP-1对受体酪氨酸激酶的抑制作用是通过直接作用于受体而使其脱磷酸化完成的，而对细胞因子受体的抑制作用则是通过与受体的非催化亚单位结合使相关的Janus家族酪氨酸激酶脱磷酸化实现的。人类SHP-1基因定位于12p13，白血病细胞蛋白酪氨酸磷酸酶能特异地对细胞内磷酸化的酪氨酸残基去磷酸化，与细胞的增殖分化密切相关，而增殖分化障碍正是肿瘤细胞的特征之一[5]。SHP-1与造血细胞的发生发展、增殖以及受体介导的有丝分裂信号转导通路密切相关，在信号转导中主要起负调控作用，抑制细胞增殖， 与肿瘤的形成及生长呈负相关[6，7]。本研究结果显示，正常对照组和缓解组SHP-1表达阳性率和表达水平显著高于初治组和复发组，后两者与正常对照组比较有统计学差异，表明SHP-1的低表达或不表达与AL的发病密切相关，说明SHP-1作为一个抑癌基因在AL中发挥着重要作用。Oka等[6]应用RT-PCR方法检测NK/T细胞淋巴瘤时发现SHP-1基因的表达显著减少，这一结果强烈提示SHP-1作为一个抑癌基因在白血病、NK/T细胞淋巴瘤及其他恶性淋巴瘤中发挥着重要作用。此外，AML患者SHP-1的表达阳性率和表达水平高于ALL患者(SHP-1在ALL几乎不表达)(P=0.038)，推测SHP-1在髓细胞白血病较易于表达，SHP-1的不表达与临床上成人ALL完全缓解率低且复发率高有关，但本实验ALL例数较少，需要进一步增加例数证实。对30例初治AML患者SHP-1 mRNA的表达情况研究发现，SHP-1表达阳性者经治疗后完全缓解率高，与SHP-1阴性表达者的完全缓解率有统计学差异。由此初步得出结论：SHP-1在初治AML中的表达可能是其预后良好的指标，从而证实SHP-1作为一个抑癌基因在AML中发挥着重要作用。c-kit原癌基因是酪氨酸激酶受体家族Ⅲ类的一个重要成员 。SHP-1与c-kit间有一定关系。SHP-1通过它的SH2功能集团与c-kit受体结合，通过直接脱磷酸化而起到对c-kit的负性调节作用[8]，c-kit基因是促使细胞增殖的重要调节因子，大量研究表明c-kit是一肿瘤基因。不论是SHP-1基因SH2功能集团的突变还是c-kit基因上与SHP-1基因的结合位点发生突变，都可导致SHP-1基因对c-kit基因的负性调节作用丧失，而表现出c-kit基因促使细胞有丝分裂增加等肿瘤基因特性。同时，丢失了SHP-1的作用还可增加c-kit的信号而导致细胞生存期的延长。运用非参数相关分析，发现SHP-1与c-kit的mRNA水平成负相关(非参数相关分析，r=-0.502，P<0.05)，且SHP-1+/ c-kit+患者缓解率高于SHP-1-/ c-kit+患者，这可能与机体内同时存在SHP-1的不表达，丢失了SHP-1的负调控作用，从而增加了c-kit的信号而导致细胞生存期的延长有关。研究证实了SHP-1可负性调节c-kit基因而抑制肿瘤的发生，今后将增加试验例数以进一步检验该结论。此外，Bene等[9]检测1 937例AML中的表达率为63%-69%;陈骅等[10]检测58例AML中的表达率为63.7%，且提示c-kit在粒细胞系白血病更易于表达。本研究结果显示，AML患者c-kit mRNA表达阳性率和表达水平显著高于ALL患者，差别有显著性，与文献报道相符。此外，对30例初治AML患者 c-kit表达水平研究发现c-kit表达阳性者CR率低于阴性者，说明监测AML患者c-kit的表达可作为又一个判断预后的独立的因素，支持c-kit和SHP-1一样可作为AL治疗转归的预测指标。

　　【参考文献】

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　　8 Kozlowski M, Larose L, Lee F, et al. SHP-1 binds and negatively modulates the c-kit receptor by interaction with tyrosine 569 in the c-kit juxtamembrane domain.Mol Cell Biol,1998;18:2089-2099

　　9 Bene MC, Bernier M, Casanovas RO,et al. The reliability and specificity of c-kit for the diagnosis of acute myeloid leukemias and undifferentiated leukemias. Blood, 1998; 92: 596-599

　　10 陈烨，许利华，董志珍等.c-kit基因在急性非淋巴细胞白血病患者的表达及临床意义.中华血液学杂志, 2003;24: 161-162.