脑梗塞大鼠脑组织水肿与脑脊液ApoE多态性关系

      作者：马萍 作者单位：哈尔滨医科大学大庆校区基础部解剖教研室，黑龙江 大庆市 163319

　　【摘要】 目的：探讨脑梗塞大鼠脑脊液载脂蛋自E(ApoE)基因多态性与周围脑组织水肿的关系。方法：对ApoE基因扩增DNA，进行AfI Ⅲ和Hae Ⅱ双酶切技术，检测16例脑梗塞大鼠ApoE基因型频率，根据脑梗塞大鼠标本切片计算脑水肿指数，统计学分析它们之间的关系。结果：脑水肿指数与ApoE3呈负相关，而与ApoE4呈正相关，两者都具有统计学意义，脑梗塞大鼠脑脊液ApoE3和ApoE4与周围脑组织水肿具有相关性。 结论：脑梗塞大鼠脑脊液ApoE多态性可能是影响周围脑组织水肿的因素之一。

　　【关键词】 脑梗塞,脑水肿,载脂蛋自E类

　　Abstract：ob[x]jective:To study the relationship between cerebrospinal fluids apolipoprotein E(ApoE) polymorphism and brain edema in rats with cerebral infarction.Methods:The cerebrospinal fluids ApoE genetic polymorphism was analyzed by PCR and AfI Ⅲ and Hae Ⅱ double enzyme digestion.The edema index was estimated by pathological methods in 16 rats with cerebral infarction.The relationship between cerebrospinal fluids apolipoprotein E(ApoE) polymorphism and brain edema was analyzed by statistic software.Results:There was negative correlation between brain edema index and ApoE3(r=-0.434,P<0.05) and positive correlation between brain edema and ApoE4(r=0.415,P<0.05).Conclusion:The cerebrospinal fluids ApoE polymorphism may be one of the factors affecting the brain edema in rats with cerebral infarction.

　　Author′s　address：Department of Found,Daqing Part,Haerbin Medical University,Daqing,Heilongjiang,163319,China

　　Key words：Cerebral infarction;Brain edema;Cerebrospinal fluid;Apolipoprotein E category

　　脑梗塞(cerebral infarction,CI)的发病率、病死率和致残率都较高，是危害人类生命健康的主要疾病，近年来其发病率有逐年上升的趋势。急性期脑水肿是导致病情加重的主要原因，控制继续损伤和减轻脑水肿是治疗脑梗塞的关键。但水肿的发生和发展机制目前仍不清楚。探讨脑水肿规律及其机制，对临床上治疗和控制病情的进展至关重要。目前有文献报道认为载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因在颅脑损伤后起着重要的作用[1,2]，并具有多态性，且各基因型具有不同的功能，为此，本研究应用大脑中动脉栓线技术，建立脑梗死大鼠模型，观察其是否与脑水肿的发生有相关性。

　　1 资料与方法

　　1.1 实验动物

　　成年雄性Wistar大鼠40只，体重250～300 g，购自哈尔滨医科大学临床医学院实验动物中心，合格证号:黑动字第P00102008号，以标准饲料喂养和饮用纯净水，处于恒温(20～25℃)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 模型制作：(1)栓线处理:选用直径为0.20～0.25 mm的强力钓鱼线，剪成长为40mm的栓线，线前端经洒精灯处理成光滑球型，在手术显微镜下观察其光滑程度，不合格的剔除，合格的栓线消毒后放入生理盐水中备用;(2)造模:在室温22℃条件下，大鼠称重后，用200g/L氨基甲酸乙酯腹腔麻醉(1.0～1.2g/kg)，将大鼠仰卧固定在实验手术台上。颈部备皮、常规消毒后，行正中切口，沿双侧颌下腺中间剪开浅筋膜，钝性分离右侧胸骨舌骨肌与胸锁乳突肌之间的肌间隙，暴露颈总动脉和迷走神经。钝性分离颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，结扎颈外动脉及颈总动脉近心端，并于颈总动脉远心端备线，颈内动脉远心端用微动脉夹夹闭，参考Zea-Longa方法[3]，于颈总动脉近分叉处切口,插入相应直径的栓线，收紧备线，打开动脉夹，栓线进入颈内动脉，插入方向稍向外侧，以防进入翼腭动脉，当栓线进入15～19mm时，可感到手下有阻力感，证明栓线头端已达大脑中动脉处，进线至大脑前动脉近端，阻断大脑中动脉的所有血液来源，扎紧备线，固定纤维，缝合，切口局部撒消炎粉，术后动物注意保温。

　　1.2.2 神经症状的观察与测定：造模大鼠30只，死亡9只，脑梗塞大鼠模型21只，待大鼠清醒后，按Bederson[4]评分法判断模型制作是否成功。Ⅰ级：将大鼠尾巴提起.瘫痪侧前肢回收屈曲于腹下，正常侧前肢向地面伸展;Ⅱ级：除Ⅰ级体征外，向瘫痪侧推大鼠时阻力较健侧明显减低;Ⅲ级：除以上体征外，大鼠有向瘫痪侧旋转行为。其中符合标准的有16只。

　　1.2.3 标本制备及脑水肿指数测定：脑脊液标本制备：脑损伤血肿周围基底节、血肿侧皮质脑组织含水量72 h明显增加[5]，见图2。在实验72h后,以10%水合氯醛麻醉(350mg/kg)大鼠，从寰枕膜处收集脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)100μl，造模72h后处死大鼠，立即取脑，于-20℃冰箱中冰冻约10 min，取出，沿冠状切成约2mm厚的脑片，置于2%的氯化四唑(TTC)中，37℃恒温水浴箱中显色10min后取出脑片，用4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定，用凝胶成像系统进行图像分析，计算梗塞面积(S1)及包括周围水肿范围的大面积(S2)，脑水肿指数EI=(S2-S1)/S1

　　图1 正常脑组织(略)

　　图2 梗塞3d周围细胞明显水肿(略)

　　1.2.4 ApoE基因双酶切多态性分析

　　取脑脊液100μl用蛋白酶K消化，按标准酚、氯仿、异戊醇法提取DNA，由Beack|man紫外/可见光核酸分析仪测DNA浓度;上海生物工程技术有限公司合成的一对引物，序列为P1:5′-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCCCA-3′，P2:5′-GCCCCGGCCTGGTACACTGCCA-3′，反应条件为：按94℃变性30s,55℃退火30s,70℃延伸90s，进行40个循环。在消毒灭菌的反应管内依次加入25μl扩增产物，5μ1的10×缓冲液含2.5 U的限制性内切酶AfI Ⅲ和Hae Ⅱ 5 U，混合均匀，置37℃水浴消化2h，-4℃终止消化。酶切后的产物用4%琼脂糖(promega公司用于小片段分离)电泳,80V电压电泳2 h,溴化乙锭(EB)染色,紫外灯下分析酶切产物(见图3)。

　　图3 ApoE基因Hae Ⅱ酶切片段电泳图谱(略)

　　1.3 统计学分析

　　采用频率计数法计算ApoE各等位基因频率，实验数据用均数±标准差(±s)表示，计量资料用t检验，等位基因频率的差异用x2检验，使用SPSS 11.0统计软件包进行统计学处理，用Spcarman相关系数分别检验脑水肿指数与ApoE3及ApoE4的相关关系。

　　2 结果

　　见表1。随着ApoE3的增高，脑水肿指数有下降趋势，而随着ApoE4的增高，脑水肿指数则有升高趋势，统计学分析显示“脑水肿指数与ApoE3呈负相关(r=-0.434,P<0.05)，见图4;而脑水肿指数与ApoE4呈正相关(r=0.415,P<0.05)，见图5。

　　表1 各组大鼠脑脊液中ApoE表达值(略)

　　注：与正常组比较△△P<0.01。

　　图4 脑水肿指数(略)

　　图5 脑水肿指数(略)

　　3 讨论

　　ApoE基因共有3个等位基因分别为ε2,ε3和ε4，并由此产生6种基因型[6]即ApoE2/2,E3/3,E4/4三种纯合子型和ApoE2/3,E2/4,E3/4三种杂合子型。ε3,ApoE3/3分别是常见的等位基因和基因型，其基因频率为77%，ε2基因频率为8%，ε4基因频率为15%。由于ApoE多态性具有重要的生物学特性，所以对ApoE多态性的实验研究对临床具有重要指导意义。

　　脑脊液中的ApoE由脑星形胶质细胞和小胶质细胞合成，浓度约为血浆中的1/10，是脑脊液中的主要载脂蛋白，且具有独立的调节机制，主要通过与LDL受体相关蛋白或LDL及相关的VLDL受体结合机制进入神经元细胞[7]。大量文献报道脑脊液ApoE在颅脑外伤后有脑保护作用，并且脑脊液中ApoE浓度与患者病情及预后密切相关。尽管损伤后血浆中ApoE可能渗漏到脑脊液中，但脑脊液中ApoE浓度仍然降低，可能的原因是损伤后胶质细胞反应性合成减少或ApoE代谢加快[8]。近来的研究表明，由于ApoE的多态性各等位基因在脑中有不同甚至相反的生物功能[9]。有人在启动子控制下制作了ApoE3或ApoE4转基因鼠，转基因鼠经历了60min的大脑中动脉堵塞，在恢复血供24h后，检测发现ApoE组梗塞灶较小，且ApoE3组偏瘫发生较轻，提示ApoE3与ApoE4可能存在不同的作用[10]。

　　Lynch等[11]研究表明ApoE与颅脑损伤后脑水肿有关。他们认为这可能因为ApoE可减轻组织细胞炎症反应及保护血脑屏障，但未对其多态性做进一步分析。本研究根据实验大鼠脑切片计算脑水肿指数，结果显示脑水肿指数与ApoE3负相关，而与ApoE4正相关，两者都具有统计学意义。这提示脑脊液ApoE3和ApoE4与周围脑组织水肿程度存在密切关系，且二者可能具有相反的生理功能。

　　脑梗塞是常见的疾病，容易发生脑水肿，导致颅内压升高，进而造成继发性脑损伤，患者残死率高[12]。因此，预防和控制脑水肿已成为脑梗塞治疗的关键问题。许多学者对ApoE基因治疗颅脑损伤给予了很高的期望，体内外实验均已证实转入ApoE3基因对神经细胞有保护作用[13]。鉴于ApoE3基因在减轻脑水肿中的积极作用，我们认为利用腺病毒载体转导，向脑室内或脑组织局部注射外源性ApoE3基因可能对提高颅脑损伤患者的临床疗效有一定帮助。