化合物OCAM的体外抗肿瘤活性

    作者：柳旺艳,李娟,李岩,刘东艳,李静　　作者单位：吉林大学公共卫生学院，吉林长春

    肿瘤的化学药物治疗是一种全身性治疗，在肿瘤综合治疗中占有很重要的地位，虽然目前已有许多抗肿瘤药物用于临床，对大多数肿瘤也有一定疗效，但仍然存在治疗效率不高、选择性差、毒副反应大及瘤细胞耐药等问题。寻找高效、低毒、特异的抗肿瘤药物仍是肿瘤药物治疗的重要课题。本文采用体外实验方法探讨金刚烷胺修饰物OCAM的体外抗肿瘤活性，为其进一步应用提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验药物

　　金刚烷胺修饰物OCAM由吉林大学公共卫生学院卫生检验教研室提供。

　　1.2 细胞株

　　人肝癌SMMC7721细胞、小鼠H22肝癌细胞和HL7702人肝细胞均为吉林省肿瘤医院肿瘤研究所提供。

　　1.3 试剂

　　RPMI1640培养液(GIBCO公司);胎牛血清(GIBCO公司);胰蛋白酶(DIFFICO公司);甲基偶氮唑蓝([3(4,5)dimethylthiazol2nyl]2,5diphenyltetrazoliumbromide，MTT，AMRESCO分装);氟尿嘧啶(5Fu，上海旭东海普药业有限公司)。

　　1.4 方法

　　1.4.1 MTT法检测OCAM对HL7702人正常肝细胞的毒性

　　将传代后第2天处于对数增殖期HL7702细胞，用含50mL/L小牛血清的RPMI1640培养液制成单细胞悬液，细胞以1×105个/孔的密度接种于96孔板，每孔中分别加入细胞悬液100μL，在体积分数50mL/L CO2，37℃，饱和湿度下培养24h后，实验组以100μL/孔加入质量浓度分别为750mg/L、500mg/L、250mg/L、100mg/L、50mg/L的化合物OCAM;阳性对照组和空白对照组分别加入100μL/孔5Fu(100mg/L)和RPMI1640培养液，每组设6个复孔，在570nm波长下用酶标仪测定吸光度(absorbance, A)，计算细胞毒百分率，用相应软件计算得出半数毒性浓度(mediallethaldose, TC50)。

　　1.4.2 MTT法检测OCAM对SMMC7721人肝癌细胞的抑制作用

　　按1.4.1方法检测质量浓度分别为200mg/L、100mg/L、50mg/L、25mg/L、12.5mg/L的OCAM对SMMC7721人肝癌细胞的抑制作用，计算药物对肿瘤细胞抑制率(inhibitionrate, IR)，用相应软件计算得出半数抑制浓度(50% inhibitingconcentration, IC50)。

　　1.4.3 台盼蓝染色法检测OCAM对H22肿瘤细胞的抑制作用

　　将H22肿瘤细胞调至1×105个/mL，以0.05mL/孔接种于24孔板上，然后实验组加入0.05mL/孔化合物OCAM(质量浓度分别为1000mg/L、500mg/L、100mg/L、50mg/L);阳性对照组和空白对照组分别加入0.05mL/孔5Fu(100mg/L)和RPMI 1640培养液，每组设3个复孔。作用24h后，用4g/L台盼蓝染液染色，在显微镜下用血细胞计数板计数活细胞数和死细胞数，计算抑制率。

　　1.4.4 SMMC7721肿瘤细胞集落形成实验

　　将SMMC7721肿瘤细胞1500个/孔接种于6孔板。培养24h后依次加入2.0mL/孔化合物OCAM(质量浓度分别为750mg/L、500mg/L、250mg/L);阳性对照组和空白对照组分别加入2.0mL/孔5Fu(250mg/L)和RPMI 1640培养液，培养2周，加入甲醇固定经姬姆萨应用液染色，空气干燥后在显微镜下计数大于50个细胞的克隆数，计算集落抑制率。

　　1.4.5 SMMC7721肿瘤细胞凋亡及细胞周期分析

　　将SMMC7721肿瘤细胞悬液调浓度至6×105/mL。取24孔平底培养板，每孔加入细胞悬液500μL，CO2孵箱中孵育16h，将化合物OCAM以25mg/L、50mg/L的质量浓度0.5mL/孔依次加入24孔板，空白对照组加入培养液0.5mL/孔，每组5复孔，同样条件下培养48h，取单细胞悬液，用Hanks液离心洗涤2次，每次1000r/min，5min，调细胞浓度为2×106/mL，取1mL细胞悬液，加入等体积RNA酶，37℃消化30min，再加入等体积PI染液，4℃染色30min，用流式细胞仪测定，ModiFit软件分析细胞周期。

　　1.5 统计学处理

　　数值变量结果以±s表示。应用SPSS 14.0统计软件，多组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MTT法检测OCAM的细胞毒性和抑瘤效应

　　由表1、表2可见，当OCAM剂量达到250mg/L时，OCAM对HL7702人正常肝细胞开始出现毒性作用(P<0.05)，抑制率为19.87%，半数毒性浓度TC50=616.68mg/L。当剂量为12.5mg/L时，OCAM即对SMMC7721肝癌细胞产生杀伤作用(P<0.05)，抑制率为7.49%。当剂量达到200mg/L时，OCAM对SMMC7721肝癌细胞的抑制率达到70.99%，半数抑制浓度IC50=87.11mg/L。表1 OCAM对HL7702人正常肝细胞的体外抑制作用(略)表2 OCAM对 SMMC7721肿瘤细胞的体外抑制作用(略)

　　2.2 台盼蓝染色法检测OCAM对H22肿瘤细胞的抑瘤效应

　　用台盼蓝染色法检测化合物 OCAM 对小鼠肝癌H22细胞的杀伤作用。当剂量达到100mg/L时，化合物 OCAM即对H22肿瘤细胞产生杀伤作用(P<0.05)，抑制率为47.49%(表3)。表3 OCAM对H22肿瘤细胞的体外抑制作用(略)

　　2.3 SMMC7721 肿瘤细胞集落形成实验

　　当剂量达到 250mg/L时，化合物 OCAM对SMMC7721肝癌细胞的集落形成抑制率为98.65%;剂量达到500mg/L时，集落形成抑制率达到(表4)。表4 OCAM对SMMC7721肿瘤细胞的集落形成抑制作用(略)

　　2.4 细胞凋亡和细胞周期分析

　　与空白对照组比较，实验组细胞G0/G1期比例明显增加，由52.88%增至61.82%和75.76%，且随给药剂量增加，G0/G1期比例增大。空白对照组的肿瘤细胞凋亡率为5.93%，而实验组的肿瘤细胞凋亡率分别为21.68%和20.05%，均有增大(图1)。

　　3 讨论

　　体外实验筛选化合物的抗肿瘤活性，是抗肿瘤药物研发中的重要步骤，具有操作简便、用药量少、实验周期短等优点。目前主要有美蓝法、细胞拒染法、细胞还原法(MTT)、荧光测定法、化学发光法、同位素释放法等筛选方法。MTT法检测细胞增殖具有简单、快速、高效、灵敏、重复性高等特点，广泛用于体外肿瘤的药敏测定[12]。其原理是MTT可透过细胞膜进入细胞内，而活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的甲臜(Formazan)结晶并沉积在细胞中，结晶物被二甲基亚砜溶解，通过检测其吸光度值的改变可判断细胞的活性，了解药物的保护作用，从而进行药效的定量分析[34]。金刚烷胺是饱和三环癸烷的氨基衍生物，是早用于抑制流感病毒的抗病毒药[56]。有研究显示，美金刚胺(memantine)作为Ⅳ甲基D天冬氨酸盐(Nmethy1 D.aspartate, NMDA)受体拮抗剂可能对神经组织的肿瘤生长有抑制作用[7]。金刚烷胺类化合物结构简单、稳定性好，本课题组近年来已合成了多种金刚烷胺修饰物，对其抗肿瘤作用进行了筛选。本实验采用MTT法和台盼蓝染色法测定了化合物OCAM在不同浓度和作用时间下对人肝癌细胞SMMC7721和小鼠肝癌细胞H22的抑制作用，结果表明OCAM从25mg/L到200mg/L的浓度范围内对人肝癌细胞SMMC7721都表现出明显的抑制作用(P<0.01)，高抑制率达到70.99%，半数抑制浓度IC50为87.11mg/L。OCAM浓度为100mg/L时，即对H22肿瘤细胞产生杀伤作用，抑制率为47.49%。提示OCAM在体外有较好的抗肿瘤活性。用MTT法检测化合物OCAM对人正常肝细胞HL7702的细胞毒作用，结果显示OCAM在浓度为100mg/L时对于人正常肝细胞HL7702已无明显毒性抑制作用，100mg/L 5Fu对人正常肝细胞HL7702却达到34.54%，OCAM的半数毒性浓度TC50为616.68mg/L。减少对正常细胞的毒作用，提高抗肿瘤药物杀伤作用的选择性一直是抗肿瘤药物研究中的一项重要指标，本实验结果提示与5Fu相比较，化合物OCAM具有较好的选择性杀伤肿瘤细胞作用。

　　集落形成实验是反映单个细胞增殖潜力的一种较灵敏的检测法[8]。恶性肿瘤组织中的克隆原细胞具有无限制的增殖能力，在体外培养中单个克隆原细胞可形成集落。它与肿瘤的治愈、复发或转移关系密切，是放射治疗及抗癌药物治疗的靶细胞。本研究中OCAM在较小剂量(250mg/L)时，对SMMC7721肝癌细胞的集落形成抑制率就达到98.65%，OCAM剂量为500mg/L时，集落形成抑制率达到，可见其对SMMC7721肿瘤细胞的增殖有较强的抑制作用。

　　本研究通过流式细胞术检测SMMC7721肿瘤细胞的细胞周期，结果显示化合物OCAM组G0/G1期比例均明显高于对照组，提示OCAM可能通过阻滞肿瘤细胞于G0/G1期，抑制肿瘤细胞的增殖速度，而达到抗肿瘤的目的。

　　综上所述，金刚烷胺修饰物OCAM具有较好的体外抗肿瘤活性，对肿瘤细胞的杀伤作用具有一定的选择性，有可能开发成为一种新型的抗肿瘤药物。