宁夏回、汉族人群MTHFR基因多态性与冠心病的关联性研究

　作者：顾燕宁,贾绍斌　　作者单位：宁夏煤炭大武口医院， 宁夏 大武口 753000 宁夏医科大学附属医院，宁夏 银川 750004

　　【摘要】目的 研究宁夏回、汉族亚甲基四氢叶酸还原酶( MTHFR)基因C677T多态性与冠心病之间的关系。方法 对回、汉族186例冠心病患者和175例对照者，应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)分析检测MTHFR基因C677T多态性。结果 回、汉族冠心病组和对照组MTHFR C677T CC、CT、TT三种基因型分布(回族，χ2 =5.523，P=0.063;汉族，χ2 =3.810，P=0.149)和等位基因频率分布(回族，χ2=0.000，P=0.984;汉族，χ2=1.366，P=0.243)差异无统计学意义;冠心病组和对照组内回、汉不同民族基因型分布和等位基因频率分布差异亦无统计学意义。结论 亚甲基四氢叶酸还原酶基因MTHFR C677T存在多态性，回、汉族间差异无统计学意义。

　　【关键词】 回族; 汉族; 亚甲基四氢叶酸还原酶; 冠心病; 基因多态性

　　Relationship between gene polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase and coronary heart disease in Ningxia Hui and Han people GU Yan-ning, JIA Shao-bin. (The Second hospital of Ningxia Dawukou, Dawukou 753000, China)

　　[Abstract] ob[x]jective To study the correlation between gene polymorphism of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T gene and Coronary Heart Disease (CHD) in Ningxia Hui and Han ethnic groups.Methods In 186 CHD patients and 175 control subjects from Hui and Han ethnic groups, polymerise chainreaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was applied to analyze the polymorphism of MTHFR gene C677Results There was no statistical significance in the genotype distribution(Hui ethnic group χ2 =5.523，P=0.063; Han ethnic group χ2=3.810， P=0.149) and allele frequency distribution(Hui ethnic group χ2 =0.000， P=0.984; Han ethnic group χ2 =1.366， P=0.243) of MTHFR C677T between CHD group and the control group in Hui and Han ethnic groups and there was no statistical significance in the genotype distribution and allele frequency distribution between the two ethnic groups within GHD group and the control group.Conclusion There is polymorphism in gene MTHFR C677T. There is some difference between the two ethnic groups.

　　[Key words] Hui ethnic groups; Han ethnic groups; Methylenetetrahydrofolate reductase; Coronary Heart Disease; Gene polymorphism

　　冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease)简称冠心病(coronary heart disease，CHD)是临床上为多见的心血管疾病， 发病率和病死率都较高，是影响人类生活质量的重大疾病。研究表明，血同型半胱氨酸 (homocysteine， Hcy)升高是动脉粥样硬化性疾病的一个独立危险因素，因此，高同型半胱氨酸血症与冠心病的发生可能有一定关系。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是同型半胱氨酸再甲基化代谢途径中的关键酶之一。此酶活性降低是导致血中Hcy堆积的重要原因[1]。目前对MTHFR基因突变与冠心病相关性的研究较多，但得到的结果并不一致。我们以宁夏回族和汉族人群为研究对象，应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测该突变在回汉族冠心病人群和正常人群中的分布， 探讨亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR基因多态性与冠心病的关系。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象:选取2007年4月至2008年3月在宁夏医科大学附属医院心内科住院行选择性冠状动脉造影术的361例患者。按照冠状动脉造影(采用Judkin's 法)结果分为冠心病组:冠脉造影显示左冠脉主干(LM)、左前降支(LAD， 含主要对角支)、左回旋支(LCX，含主要边缘支)或右冠脉(RCA， 含后降支或左室后侧支)中至少1支血管狭窄程度≥50%(用直径法测定病变的狭窄程度)。共186例，男131例，女55例，平均(64.93±11.04)岁。所有病例为宁夏地区的回族和汉族人，其中回族107例，汉族79例。均符合国际心脏病学会及世界卫生组织(1979年)制定的缺血型心脏病的临床诊断标准。正常对照组:共175例，男114例，女61例，平均(62.85±11.23)岁。所有病例为宁夏地区的回族和汉族人，其中回族117例，汉族58例。所有患者肝肾功能正常， 相互间无血缘关系。

　　1.2 方法

　　1.2.1 DNA提取：采集外周静脉血2ml ， 枸椽酸钠抗凝， 低渗溶血法获得白细胞， 以常规酚/氯仿抽提法提取DNA ， TE 溶解后于-70℃保存。

　　1.2.2 PCR 扩增引物：MTHFR C677T引物使用为:上游5’AGC TTT GAG GCT GAC CTG AAG 3'，下游5’AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG 3'

　　1.2.3 PCR扩增体系及参数：MTHFR PCR反应总体系为25μl， 含2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，上、下引物各1μl， 模板DNA 5μl，灭菌双蒸水5.5 μl。MTHFR C677T PCR 反应程序:95℃ 5 min，35个循环(95℃ 30 s，65℃ 45 s，72℃ 30 s)，72℃ 7 min。扩增产物为223 bp。

　　1.2.4 限制性酶：C677T位点取PCR产物10μl， 5个U的HinfⅠ限制酶; 37℃水浴消化1-2 h。用2.5%琼脂糖电泳溴化乙锭染色法显色， 用紫外凝胶成像系统观察和分析基因型。

　　1.2.5 统计学处理：采用SPSS13.0软件对数据进行分析， 基因型和等位基因频率等计数资料采用直接计数法，组间率的比较采用χ2检验， 以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 酶切结果：PCR产物223bp被HinfI酶切成176 bp和47 bp 2条带，根据此判断3种基因型: 野生型CC 223 bp; 杂合型CT 223 bp及176 bp，47bp;纯合突变型TT 176 bp，47bp，结果见图1(封二)。

　　2.2 MTHFR基因型及等位基因频率比较:冠心病组及对照组MTHFR C677T基因型频率及等位基因频率分布相比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

　　表1 冠心病组和对照组MTHFR C677T基因型和等位基因频率(略)

　　3 讨论

　　人类MTHFR基因定位于染色体1p36.3 cDNA全长2220bp，共有11个外显子[2]。1995年，Frosst等[3]应用PCR-SSCP分析证明，MTHFR基因在677位发生突变与心血管疾病密切相关。由于基因在677位发生错义突变，碱基C置换为T，编码的丙氨酸由缬氨酸取代，使酶的耐热性和活性都大大降低，血浆同型半胱氨酸水平升高，进而产生高半胱氨酸血症(HHCY)。研究显示，轻、中度HHCY可使男性心血管疾病危险性增加60%，女性增加80%，相当于总胆固醇每升高20mg/dl的危险性[4]。李智文等[5]为了解我国人群MTHFR基因多态性与CHD发生的关系，通过荟萃(me[x]ta)分析法对9篇CHD文献分析， 共包括1927例研究对象，结果发现MTHFR基因C677T突变个体发生CHD的危险性显著上升。欧洲9个国家一个协作项目711例心血管患者和747例对照者进行的研究表明，特别是当血浆HCY升高和叶酸降低时，MTHFR基因C 677T突变T纯合基因型是心血管疾病的风险因子[6]。日本的研究者发现362例男性冠心病患者中MTHFR基因C677T突变T纯合基因型占16%，杂合基因型占52%，表明MTHFR基因 C677T突变与CHD发病以及冠状动脉病变程度有密切相关[7]。Andreassi[8]报道冠状动脉造影确诊的CHD患者中MTHFRTT基因型的个体比THFRCT和MTHFRCC基因型个体HCY水平高。但目前MTHFR基因与冠心病的关系尚存在很大的分歧，国内外报道不一。Rothenbacher等[9]研究表明， MTHFR基因多态性与血浆Hcy水平和冠心病无关， 而Zheng等[10]调查了122例正常受试者的研究结果也显示，MTHFR基因C677T突变与冠心病无显著性相关。Zhang等[11]和戴祟文等[12]的研究发现，MTHFR基因C677T突变不仅与冠心病、心肌梗死无关，也与缺血性卒中无明显相关。造成不同研究结果的原因可能是MTHFR基因C677T具有种族和民族的差异， 从而不同种族、不同民族对疾病的易感性不同[13]。

　　我们采用PCR-RFLP技术检测宁夏回、汉族冠心病患者与正常人群中MTHFR C677T基因中CC、CT、TT三种基因型的分布及C、T等位基因频率，研究结果提示， 冠心病组和对照组基因型分布(汉族，χ2=3.810，P=0.149;回族，χ2=5.523，P=0.063)和等位基因频率(汉族，χ2 =1.366，P=0.243; 回族，χ2 =0.000， P=0.984)差异无统计学意义(P>0.05); 冠心病组和对照组内回、汉不同民族基因型分布(冠心病组回、汉族比较，χ2=3.114， P=0.211; 对照组回、汉族比较，χ2 =0.241 ， P=0.886)和等位基因频率(冠心病组回、汉族比较，χ2 =2.751，P=0.097; 对照组回、汉族比较，χ2=0.062， P=0.803 ) 差异亦无统计学意义(P>0.05)，与以前多数研究结果不符有众多的原因。首先是地域和人种的不同，其次是不同研究人群的营养状态和体重指数不同。第三是不同研究人群的年龄不同，年老的人群无法避免存活偏倚对结论的影响。后，可能还与对照组中部分受试者有可能存在轻度冠状动脉病变但未做冠脉造影排除以及样本量不够大有关。这均有待于我们在样本量、样本构成、人种及地理差异等方面进行综合分析，以进一步确定MTHFR基因C677T突变与冠心病的关系。