Livin和Caspase3在结直肠癌组织中的表达及其相关性

　作者：李日恒,程树杰　　作者单位：河北大学附属医院，河北 保定 071000

　　【摘要】目的 确定Livin蛋白和Caspase3蛋白在结直肠癌组织细胞中的定位，并分析其与临床病理特征的相关性。方法 应用免疫组化技术检测Livin蛋白和Caspase3蛋白。结果 结直肠癌组织Livin高表达，同时Caspase3低表达;正常大肠组织及结肠腺瘤息肉中无Livin表达，而Caspase3高表达。Livin蛋白定位于细胞质中;Caspase3蛋白绝大多数定位于细胞质，极少数定位于细胞核中。结论 Livin 基因激活与结直肠癌发生、发展相关，促凋亡基因Caspase3与凋亡抑制基因Livin共同调节参与了结直肠癌的发病机制。Livin蛋白的表达与结直肠癌分化程度明显相关，分化越低，表达越高;与结直肠癌的临床分期、淋巴转移无关。
　　【关键词】 结直肠癌;细胞凋亡;凋亡抑制蛋白;Livin;Caspase3

　　应用免疫组化法对60例结直肠癌组织、30例结直肠腺瘤、息肉组织和10例正常结直肠组织中Livin蛋白和Caspase3蛋白的表达进行检测，了解Livin蛋白和Caspase3蛋白在这些组织中的表达情况，探讨Livin和Caspase3在结直肠癌组织中的表达及其相关性，旨在为结直肠癌的诊断及治疗寻求一个新的途径，并提供观察疗效的新指标。
　　1 资料与方法
　　1.1 临床资料

　　收集河北大学附属医院2004～2008年结直肠癌手术标本80例，全部标本经10%甲醛固定，石蜡包埋。经重新复阅切片，对诊断明确、资料完整的60例结直肠癌进行研究。所有病例术前均未行放疗及化疗。组织病理学分类：“黏液癌”10例包括黏液腺癌、印戒细胞癌;“非黏液癌”50例包括乳头状腺癌、管状腺癌及未分化癌。高分化15例，中分化29例，低分化16例;结直肠癌临床病理分期根据Dukes分期标准，A期16例，B期18例，C期17例，D期9例;有淋巴结转移14例，无淋巴结转移46例。30例纤维结肠镜下手术切除后经病理检查证实的结直肠腺瘤、息肉组织标本和10例结肠冗长症等疾病手术切除标本中的正常结直肠组织标本。患者年龄34～86岁，平均62岁。
　　1.2 方法

　　标本经甲醛固定，石蜡包埋，切片厚度为3 μm。采用SP法，一抗兔抗人Livin多克隆抗体(美国ADI公司生产)，兔抗人Caspase3多克隆抗体(购于武汉博士德生物工程有限公司)。免疫组化染色即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。PBS替代一抗为阴性对照。
　　结果判定： Livin、Caspase3阳性染色均为棕黄色颗粒，计算阳性细胞数，分级方法如下：(-)为无棕黄色颗粒，(+)为阳性细胞数介于1%～25%，()为阳性细胞数在25%～50%，()为阳性细胞数>50%。进行统计学分析时，+～均作为阳性表达。
　　1.3 统计学方法
　　数据采用SPSS12.0统计软件进行统计学分析，率的比较采用χ2检验。
　　2 结 果
　　2.1 Livin蛋白表达情况

　　10例正常结直肠组织及30例结直肠腺瘤、息肉组织中均未发现黄色或棕黄色染色颗粒。60例结直肠癌组织中有42例Livin蛋白表达阳性，阳性率为70%。细胞质中发现棕黄色染色颗粒，表明Livin蛋白在结直肠癌组织中定位在细胞质中。结直肠癌组织中Livin蛋白高表达与正常结直肠组织、结直肠腺瘤、息肉的表达差异显著(P<0.001)。Livin蛋白的表达与结直肠癌患者的病理分型﹑淋巴结转移及Dukes分期均无明显相关关系，而与肿瘤分化程度明显相关(P<0.05)，见表1。表1 Livin蛋白、Caspase3蛋白与结直肠癌组织病理分级的关系

　　2.2 Caspase3蛋白表达情况

　　Caspase3蛋白在10例正常结直肠黏膜有8例阳性，阳性率为80%;30例结直肠腺瘤、息肉组织中有18例阳性，阳性率为60%。阳性细胞多数定位于细胞质，有6例定位在细胞核中，呈棕黄色颗粒。60例结直肠癌组织中有27例Caspase3蛋白表达阳性，阳性率为45%。Caspase3蛋白在正常结直肠组织、结直肠腺瘤、息肉中的阳性表达与结直肠癌组织中的表达差异显著(P<0.05)。Caspase3蛋白的表达与结直肠癌患者的病理分型﹑淋巴结转移及Dukes分期均无明显相关关系(P>0.05)，而与肿瘤分化程度明显相关(P<0.01)，见表1。
　　2.3 Livin蛋白与Caspase3蛋白阳性表达的相关性
　　Livin蛋白在结直肠癌组织、结直肠腺瘤、息肉、正常大肠表达阳性率分别为70%、0、0;Caspase3蛋白在结直肠癌组织、结直肠腺瘤、息肉、正常大肠表达阳性率分别为45%、60%、80%，二者呈反向关系。
　　3 讨 论
　　结直肠癌是一种严重危害人类健康的消化系恶性肿瘤。近年来，结直肠癌的基础和临床研究已取得很大进步，但病因学和发病机制尚未完全阐明。
　　Livin是2000年发现的凋亡抑制蛋白(IAPs)家族新成员，在胚胎组织中存在，在胎儿发育过程中多种组织高表达，在正常成人的大多数终末组织中(除胎盘)低表达或不表达，正常大肠组织中无Livin基因的表达〔1～4〕。Livin的细胞定位各方报道不一。Ka等〔5〕以免疫组化法对不同时期的胎盘、滋养层细胞和绒毛膜癌细胞系染色，阳性显色仅定位于胞核。Kasof等〔2〕用含有Livin基因的质粒转染HeLa细胞并予相应抗体检测其表达产物，发现细胞核及胞浆内同时呈纤维细丝样染色，与survivin细胞内分布相似。Hariu等〔6〕检测肺癌，免疫组织化学染色显示肺癌细胞的Livin蛋白在胞浆和胞核均有显色。
　　细胞凋亡是维持内环境稳定的重要机制之一。Caspase是执行凋亡的主要酶类，其中Caspase3是Caspase中的关键效应酶，是凋亡执行的重要效应分子，广泛表达于正常人体组织及多种肿瘤组织中，可作用于多种底物，其底物改变与细胞凋亡表型密切相关，在Caspase酶系级联反应中发挥重要作用。
　　Livin可以通过抑制Caspase途径达到抗细胞凋亡调节作用，Livin可与介导细胞凋亡的下游效应Caspase，即激活形式的Caspase3和Caspase7结合，并抑制其活性。Livin还可与未加工的或断裂形式的Caspase9结合，可抑制由Apaf1，细胞色素C及dATP诱导的Caspase9激活作用。Livin与Caspase的结合抑制作用具有高度的特异性和亲和性，这有赖于其BIR结构域的完整，BIR结构域内单个氨基酸的突变即可导致Livin与Caspase的结合作用及Livin抗细胞凋亡作用的明显降低甚至完全丧失。随着对多种肿瘤中Livin的研究，显示Livin在很多肿瘤组织中有过表达，如在黑色素瘤、人子宫颈癌Hela细胞、人肝癌细胞、非小细胞肺癌细胞、白血病T细胞、鼻咽癌上均有显著性过表达现象〔7～12〕，这些研究结果提示，Livin的过表达可能是维持肿瘤细胞在体内生长的重要因素。
　　近研究还发现在消化道肿瘤中，如胃癌、胰腺癌及肝癌中均见Livin呈过度表达。Yagihashi等〔13〕发现在胃肠癌患者中，Livin抗体的表达率为47%且与Survivin抗体的表达无相关性。Livin基因是某些肿瘤诊断和治疗的潜在靶点。然而，Livin基因在结直肠癌发病机制中的作用、恶性生物学行为(侵袭和转移)的表达，以及是否可作为早期诊断及治疗的靶点鲜见报道。
　　本研究采用免疫组织化学染色方法检测，确定了Livin蛋白和Caspase3蛋白在细胞中的定位，Livin蛋白定位于细胞质中;Caspase3蛋白绝大多数定位于细胞质，极少数定位于细胞核中。实验发现结直肠癌组织Livin基因高表达，同时Caspase3基因低表达;在正常大肠组织及结肠腺瘤、息肉中Livin基因无表达，而Caspase3高表达。说明促凋亡基因Caspase3与凋亡抑制基因Livin共同失调节参与了结直肠癌的发病机制。本实验进一步印证了Livin蛋白的表达与结直肠癌组织的分化程度有关，分化越低，表达越高;与结直肠癌患者的年龄、临床分期、淋巴转移无关。
　　因此可以认为肿瘤正是通过对Livin的过量表达，上调它们在有丝分裂中的抗凋亡作用，从而保持肿瘤细胞的增殖和生长，故Livin与结直肠癌的演进有关。Livin蛋白表达与结直肠癌的分化程度显著相关，几乎所有的低分化癌均可检测到Livin的过表达，而Caspases3却仅仅只有2例呈阳性表达，表明其抗凋亡作用的机制是通过Caspase途径实现的〔14〕。Caspase3在结直肠正常黏膜和结直肠癌中的表达率依次减少，提示Caspase3表达降低与结直肠癌的形成和进展有关。Caspase3表达率在结直肠癌高、中分化组明显高于低分化组，表明Caspase3表达与结直肠癌分化程度有相关关系。结直肠癌Caspase3表达阳性，可能提示癌细胞分化程度高，细胞凋亡调控机制障碍程度轻，癌细胞增殖比较弱。
　　综上结果表明，Livin和Caspase3在结直肠癌的发生和演化中起着重要的作用。Livin可能直接作用于Caspase3并抑制其活性，阻断细胞的凋亡过程，从而促进了结直肠癌的癌细胞不断增殖。Livin作为一个新的凋亡抑制基因，它的激活与结直肠癌发生、发展相关，是结直肠癌诊断和治疗的潜在靶点。