2甲氧基雌二醇对SKM1细胞凋亡中bcl2/bax表达的影响

　　作者：夏国华,陈宝安,芦慧霞,邵泽叶,丁家华　　作者单位：东南大学医学院医学检验学系,江苏 南京 210009

　　【摘要】目的探讨2甲氧基雌二醇(2ME)对骨髓增生异常综合征SKM1细胞凋亡过程中bcl2/bax表达的影响。方法 2ME与SKM1细胞共同培养，流式细胞术分析细胞凋亡率和细胞周期;RTPCR技术检测bcl2和bax mRNA表达。结果 1～8 μmol/L 2ME作用后，SKM1细胞凋亡率上升呈剂量依赖性;细胞被阻滞于G2/M期;细胞bcl2 mRNA表达量下调，bax mRNA表达量上调。结论 2ME诱导SKM1细胞凋亡与细胞G2/M期阻滞和bcl2/bax比率下降有关。
　　【关键词】 2甲氧基雌二醇;SKM1细胞系;凋亡;细胞周期;bcl2/bax

　　【Abstract】 ob[x]jective To explore the effect of 2methoxyestradiol(2ME) on cell apoptosis and the ex[x]pression of bcl2/bax ratio in myelodysplastic syndromes SKM1 cells. Methods After SKM1 cells were treated with different concentration of 2ME for several period of time, the rate of apoptosis and cell cycle status were evaluated by FCM, and the ex[x]pressions of bcl2 and bax mRNA were assayed by reverse transc[x]ription polymerase chain reaction(RTPCR).Results Different concentration of 2ME increased the rate of apoptosis in a timedependent manner and caused a sustained arrest at G2/M phase. Furthermore, 2ME significantly downregulated the ex[x]pression of bcl2 mRNA (P<0.05) and upregulated the ex[x]pression of Bax mRNA (P<0.05). Conclusions 2ME could induce SKM1 cell apoptosis by arresting cell cycle at G2/M phase and decrease the ratio of bax/bcl2.

　　【Key words】 2methoxyestradiol; SKM1 cell line; Apoptosis; Cell cycle; Bax/bcl2

　　骨髓增生异常综合征(MDS) 是血液系统的常见疾病之一，多发于老年人。有研究发现早期MDS患者的骨髓造血细胞过度凋亡，引起骨髓无效造血致外周血细胞减少〔1〕;但随着疾病进展到晚期，患者骨髓细胞的凋亡受到抑制，发生恶性克隆增殖，终可能转化为白血病。因此临床上迫切需要研究和开发新的低毒性的化疗药物，通过诱导MDS恶性克隆细胞凋亡来恢复正常造血。2甲氧基雌二醇(2ME)是近年来研究的新型抗肿瘤药物，可诱导多种肿瘤细胞凋亡，临床副作用小，作为潜在的和合适的癌症治疗药物而引起人们的关注〔2〕。本实验以人MDSRAEB细胞株SKM1为体外研究模型，初步探讨2ME诱导SKM1细胞凋亡的作用机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 主要仪器和试剂
　　FACS Calibur流式细胞仪(Becton Dickinson公司);梯度PCR仪(Eppendorf公司)。2ME、二甲基亚砜(Sigma公司);RPMI1640 (Gibco公司);Trizol提取液(Invitrogen公司);RTPCR试剂盒(TaKaRa公司);AnnexinVFITC/PI凋亡试剂盒(Becton Dickinson公司)。
　　1.2 细胞培养与预处理

　　SKM1细胞系(日本JCRB细胞库)。SKM1细胞在37℃、5% CO2、含10%FBS的RPMI1640培养液中培养，取对数生长期的细胞进行实验，实验设对照组和2ME(1、2、4和8 μmol/L)用药组。
　　1.3 细胞凋亡率检测
　　收集1×106个细胞，冷PBS洗涤2次，悬浮细胞，加5 μl AnnexinVFITC，室温避光10 min，再加10 μl PI，混合后室温避光5 min，冷PBS洗涤1次，悬浮细胞，FCM检测。
　　1.4 细胞周期分析

　　收集1×106个细胞，PBS洗2次，70%冷乙醇固定，1 ml PI(50 μg/ml)染液混匀后避光放置30 min，FCM检测，用专业软件ModFit获取分析数据。
　　1.5 RTPCR检测bcl2和bax mRNA表达

　　收集细胞提取总RNA，紫外分光光度仪测定OD260nm/OD280nm(1.8～2.0)，计算RNA含量。逆转录合成cDNA，再对其进行扩增，以βactin为内参照。引物序列如下：bcl2(452 bp)：上游5′GGAGAACAGGGTACGATA A3′，下游5′CCACCGAACTCAAAGAAGG3′;bax(275 bp)：上游5′GAGGATGATTGCCGCCGTGGACA3′，下游5′GGTGGGGGTGAGGAGGCTTGAGG3′;βactin(150 bp)：上游5′TATGACTTAGTTGCGTTACACC3′，下游5′CCTTCACCGTTCCAGTTT3′。反应参数：94℃ 5 min;94℃ 1 min，55℃ 45 s，72℃ 1 min共30循环;后72℃ 延伸10 min。取10 μl扩增产物与2 μl 6×loading缓冲液混合后，在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，柯达UV2000紫外分析仪观察和扫描分析目的基因与βactin灰度比值，进行目的基因表达的半定量分析。
　　1.6 统计学方法
　　采用SPSS13.5统计软件，数据用x±s表示，采用t检验和方差分析。
　　2 结 果
　　2.1 2ME对SKM1细胞凋亡的影响
　　2ME作用12 h，Annexin+/PI-的细胞较对照组细胞显著增加(P<0.05)。表明2ME是SKM1细胞强有力的凋亡诱导剂，细胞凋亡呈剂量依赖关系。见表1。表1 不同浓度2ME作用SKM1细胞12 h对细胞周期及凋亡率的影响

　　2.2 2ME对SKM1细胞周期的影响
　　随着2ME剂量的增加，G2/M期细胞逐渐增多，G0/G1和S期细胞逐渐减少，与对照组比较均有显著差异(P<0.05)，提示SKM1细胞被2ME阻滞于G2/M期。见表1。
　　2.3 2ME对bcl2和bax的mRNA影响

　　经2ME处理48 h，随着2ME浓度的增加，SKM1细胞bcl2 mRNA表达量下调，而bax mRNA表达量上调。方差分析表明，各处理组bcl2和bax表达量与对照组相比差异显著(P<0.05)，表明2ME可以下调SKM1细胞中bcl2/bax的比率。见图1。1：空白对照组，2：1 μmol/L 2ME组，3：2 μmol/L 2ME组，4：4 μmol/L 2ME组，M：Marker图1 2ME对SKM1细胞bcl2和bax mRNA表达的影响
　　3 讨 论
　　MDS是以血细胞质、量异常和高风险发展为急性白血病为特征的恶性克隆性造血干细胞病，大多数病人不能进行异基因造血干细胞移植，临床上寻找有效、经济的治疗方法，以提高治疗效果、延长生存期及改善患者生存质量，具有重要意义。2ME是近年来研究的新型抗肿瘤药物，具有广泛的抗肿瘤活性和对白血病细胞选择性杀伤作用〔3〕。本研究中AnnexinVFITC结合PI染色结果显示，经1～8 μmol/L 2ME作用SKM1细胞48 h时各用药组Annexin+/PI-细胞较对照组显著增加，表明2ME是SKM1细胞强有力的凋亡诱导剂。不同浓度2ME对SKM1细胞周期各时相均有影响，随着2ME剂量的增加，G2/M期细胞比例逐渐上升，G1和S期细胞逐渐减少，提示SKM1细胞被2ME阻滞于G2/M期，这是细胞损伤的普遍现象。
　　细胞凋亡是机体维持自身平衡的一种基本生理机制，在细胞凋亡的分子生物学过程中，细胞凋亡受多种基因的调控，Bcl2基因家族是一类新的癌基因家族，在细胞凋亡调控中起重要作用。bcl2凋亡控制基因家族中抗凋亡成员和促凋亡成员之间可竞争性形成同源或异源二聚体，即bcl2/bax、bclX/bax和mcl1/bax的比率决定细胞是否凋亡〔4〕。bcl2表达降低在线粒体通路中起关键性的作用，很多化疗药物通过抑制下调抗凋亡基因bcl2的表达，促使Ca2+内流，直接或间接改变线粒体膜通透性转运通道，降低ΔΨm，促进CytC和促凋亡因子的释放，与caspase9形成凋亡复合体，启动caspase3级联反应，诱导肿瘤细胞凋亡。bax基因本身并不直接诱导细胞死亡，但能加速死亡信号引起细胞凋亡的基因。本研究发现2ME下调SKM1细胞中bcl2 mRNA表达和上调bax mRNA表达，即bcl2/bax比率下降，而2ME对MDS细胞株MUTZ1细胞中bax mRNA表达量无明显影响〔5〕，表明bax基因在MDS不同细胞株中表达量不同，在加速细胞凋亡中的作用也不完全相同。
　　总之，2ME诱导SKM1细胞凋亡与细胞G2/M期阻滞和bcl2/bax比率下降有关。
　　【参考文献】
　　1 Parker JE，Mufti J.Ineffective haemopoiesis and apoptosis in myelodysplastic syndromes〔J〕.Hematology，1998;101(2):22030.

　　2 Sidor C，D′amato R，Miller KD,et al.The potential and suitability of 2methoxyestradiol in cancer therapy〔J〕.Clin Cancer Res，2005;11(16)：60945.

　　3 Huang P，Feng L，Oldham EA,et al.Superoxide dismutase as a target for the selective killing of cancer cells〔J〕.Nature，2000;407(6802)：3905.

　　4 Jacobson MD.Apoptosis：Bcl2related proteins get connected〔J〕.Curr Biol，1997;7(5):R27781.

　　5 夏国华，陈宝安，芦慧霞，等.Mcl1和Bax基因在2甲氧基雌二醇诱导骨髓增生异常综合征细胞凋亡中的调控作用〔J〕.中国实验血液杂志，2009;17(5):12468.