P-选择素、CD44v6与乳腺癌转移

作者：黄秀英　张颖　李凤玲　张素华　　作者单位：河北省保定市第四医院;河北省唐山市华北煤炭医学院病理教研室

　　【关键词】 肿瘤，乳腺;P-选择素;CD44v6

　　乳腺癌是女性常见肿瘤之一，其发病率呈上升趋势，全世界每年有一百多万女性患病。全球每年有57万女性死于乳腺癌[1]。我国近年来的统计资料显示，很多地方乳腺癌已上升至妇女恶性肿瘤的首位[2]，并且发病年龄年轻化、发病率也呈快速上升趋势。其预后与组织学分级及是否发生转移有明显关系，一旦发生转移，将严重影响患者的生存质量。如何早期将具有潜在转移危险的患者筛选出来，给予积极治疗，是提高乳腺癌生存率的关键所在。其中，远处侵袭转移是危及乳腺癌患者生命的主要原因。肿瘤的转移是肿瘤细胞与机体组织和细胞间复杂的相互作用，是一个多分子参与的高度有序的、有器官选择性的连续过程，其转移机制至今尚不十分清楚。目前已知肿瘤的浸润和转移与其粘附分子表达的改变有关。一方面肿瘤细胞某些粘附分子表达的减少可以使细胞间的附着减弱，肿瘤细胞脱离与周围细胞的附着，这是肿瘤浸润及转移的步;另一方面，肿瘤细胞表达的某些粘附分子使已入血的肿瘤细胞得以粘附血管内皮细胞，造成血行转移。细胞粘附分子按其功能和结构可分为五大类，即钙依赖粘附素、整合素、选择素、免疫球蛋白超家族和CD44。
　　1　P-选择素
　　P选择素是细胞黏附分子选择素家族中的重要成员， 介导着肿瘤细胞-内皮细胞之间的特异性粘附，是肿瘤细胞转移的关键因素。
　　1.1　P-选择素的分子结构、生物学特性及其配体
　　1.1.1　P-选择素的分子结构：P-选择素属选择素家族成员之一，其作用依赖于Ca2+。主要参与白细胞与血管内皮细胞之间的识别与粘合。包括血小板选择素(p-选择素)、内皮细胞选择素(E-选择素)和白细胞选择素(L-选择素)又为归巢受体三种。E-选择素主要表达在激活的内皮细胞表面，L-选择素表达在正常白细胞表面，在炎症和淋巴细胞归巢过程中发挥重要作用，P-选择素表达于活化的血小板和EC表面，P-选择素是一种分子量为140kda的跨膜糖蛋白，亦称P-选择蛋白、颗粒膜蛋白140(granule membrane protein，GMP-140)、血小板激活依赖性颗粒外膜蛋白(PADGEM)或称CD62P。其染色体定位于1q21-24，由41个氨基酸残基的信号肽和789个氨基酸残基的成熟蛋白构成。在结构上，P-选择素分为胞外区、跨膜区和胞浆区：胞外区由N末端730个氨基酸构成，包括1个钙离子依赖的凝集素样区(lectin-like domain)、1个表皮生长因子样区(epidermal growth factor-like domain，EGF样区)，其半胱氨酸排列结构类似于表皮生长因子前体，以及9个排列一致的短小的重复片段，称补体调节蛋白短小重复单位(complement regulatory protein：short consensus repeat units，SCR区);跨膜区是由C末端24个氨基酸组成;胞浆区由35 个氨基酸组成，称胞浆短尾区，其通过凝集素结构域来识别糖蛋白及糖脂分子上的糖配体。
　　1.1.2　P-选择素的生物学特性：P-选择素主要储存于内皮细胞的Weibel-Palade小体和血小板的α颗粒内。当细胞受刺激被激活后，含有P-选择素的颗粒膜与质膜融合，P-选择素则很快表达于细胞表面。凝血酶、细胞因子、蛋白激酶C、补体C5b9、二磷酸腺苷、LPS、TNF-α、IL-1β、组织胺或白三烯C4等都可作为其激活物。内皮细胞在正常生理情况下未被激活，P-选择素为低水平表达或不表达。在炎症等病理状况下而呈高表达状态，从而参与多种病理变化。P-选择素即表达于激活的内皮细胞，又表达于激活的血小板上，所以在肿瘤的转移中具有双重作用。P-选择素表达迅速，高峰出现在刺激后的5～10 min，约20 min后消失。这种瞬时表达可能与炎症早期有关。IL-1β、TNF-α、及细菌内毒素(如LPS)等可上调选择素的表达。
　　1.1.3　P-选择素的配体：选择素有很多种配体，如E选择素配体-1(ESL-1)、P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)、周围淋巴结地址素(PNAd)等。配体中四维结构唾液酸化LewisX和LewisA是已知三种选择素所能识别的小配体单位。P-选择素的配体都具有唾液酸化的氨基多糖结构(sLex，sLea)或类似结构。P-选择素与其配体PSGL-1高亲和力结合，与PSGL-1结构中sLex中O-连接型聚糖及硫酸化络氨酸的存在密切相关。PSGL-1一般表达于中性粒细胞、淋巴细胞和其他造血细胞。体内、体外实验表明PSGL-1是中性粒细胞和淋巴细胞与P-选择素结合所必需的。当P-选择素与白细胞表面的配体结合后，即介导白细胞的滚动，将其锚定在内皮细胞上发挥作用[4]。一般P-选择素在接受刺激后几分钟就移动到细胞表面，而E-选择素需在激活后数小时才能表达，因此认为P-选择素介导早期黏附，E选择素参与稍后的黏附反映。
　　1.2　P-选择素与乳腺癌转移
　　1.2 1　P-选择素与肿瘤转移：越来越多的证据表明P-选择素在肿瘤的转移过程中发挥了极为重要的作用。Schadendorf等[5]报道不同阶段的黑色素瘤病人血浆中P-选择素均高于正常人，且与病情发展呈正相关。Nair等[6]在食道癌患者的血浆中也检测出P-选择素的含量是升高的。在一组68例胃癌标本的研究中，P-选择素在血管内皮细胞的阳性表达率为56%，而对照组呈阴性表达，且P-选择素的高表达与淋巴结的转移率和转移程度有关，P-选择素的高表达发生在胃癌细胞[7]。并且P-选择素的高表达也与结肠直肠癌的恶性程度有关。有人用胃癌细胞株原位移植于裸鼠后，经注射P-选择素造成的肿瘤转移率明显高于对照组，肿瘤转移裸鼠的血浆P-选择素含量也显著高于非转移鼠，且P-选择素单抗对肿瘤转移有抑制作用[8]。并且肿瘤细胞可能通过促进炎细胞分泌炎性介质间接诱导选择素等黏附分子的表达。许多肿瘤细胞可以分泌血管通透因子，此因子可促使内皮细胞Weibel-palade小体释放P-选择素。值得强调的是，在对多种生殖细胞肿瘤P-选择素及其配体sLex、CD15在生殖细胞肿瘤中的高表达及意义和食管癌食管鳞癌P-选择素及其配体sialyl lewisA、sialyl lewisX的表达的研究发现，肿瘤细胞明显表达P-选择素和sLex。在循环中肿瘤细胞也可通过与炎症类似的方式黏附到血管内皮表面，提示P-选择素可能在癌细胞与血管间存在双重介导作用，此显然更有利于肿瘤浸润和转移。一般而言肿瘤大小是影响淋巴结转移的一个重要因素，因此本研究对淋巴结转移肿瘤的大小及其与淋巴结转移的关系进行了探讨。
　　肿瘤细胞在血液循环中与血小板黏附，可使瘤细胞在转移过程中免于被吞噬细胞消灭，较高的黏附能力使瘤细胞具有较高的转移活性。肿瘤患者尤其是中晚期患者血小板粘附分子的表达释放增加，血小板膜表面P-选择素明显高于正常人群。Borsig等[9]研究发现，P-选择素可以促进血小板与癌细胞黏连成瘤栓促进转移，而缺乏P-选择素或用肝素抑制剂P-选择素则可以减少血小板与癌细胞的黏附，使转移减少。Wei等[10]研究发现肝素及经过化学修正后的肝素抑制人的3种结肠癌细胞系(COLO320，LS174T and CW-2)，是通过抑制P-选择素的cDNA表达而干预癌细胞与血小板结合形成瘤栓，从而抑制转移。Stone等[11]研究了肿瘤细胞与激活的血小板和内皮细胞黏附后，发现小细胞肺癌细胞株、神经母细胞瘤细胞株和畸胎瘤细胞株由P-选择素介导与活化的血小板结合，P-选择素多抗和单抗可完全抑制血小板与肿瘤细胞的黏附;肿瘤细胞在血液循环中与血小板黏附，可使癌细胞在转移过程中免于被吞噬细胞消灭，总之，P-选择素同时介导了肿瘤细胞与血管内皮的黏附及激活的血小板与肿瘤细胞的结合。肿瘤细胞经由P-选择素和配体结合：(1)通过其带有的唾液酸增加细胞表面的负电荷以掩盖其表面抗原，使瘤细胞能逃避免疫系统的攻击。(2)介导肿瘤细胞与特定脏器脉管内皮细胞黏附，使之易于通过内皮发生转移。
　　1.2.2　P-选择素与乳腺癌转移：Caine等[12]发现乳腺癌特别是伴有转移的乳腺癌患者的血小板粘附性增高，此改变与P-选择素有关。Fox等发现P-选择素在浸润性乳腺癌组织中表达增强。另一组研究发现，P-选择素在纤维腺瘤、乳腺导管内癌及浸润性癌组织中的表达依次增高，有淋巴结转移者高于无淋巴结转移者[13]。提示P-选择素参与了乳腺癌的浸润和淋巴结转移。 Renkonen等[14]检测出乳腺癌原发灶的癌细胞P-选择素的表达明显高于正常乳腺上皮细胞，原发灶癌细胞sLea和内皮细胞sLex有过度表达，且淋巴结转移灶中的癌细胞sLea和(或)sLex的表达远高于原发灶，提示表达sLea和(或)sLex的癌细胞在表达P-选择素的血管内皮部位表达有更高的侵袭和形成转移灶的可能性。研究还发现，乳腺癌患者手术后1年复发组的血清P-选择素明显高于未复发组。此结果预示P-选择素可作为术后复发的监测指标。Currie等[15]进一步的细胞学和组织学研究揭示，乳腺癌细胞通过其自身表达P-选择素而上调血管内皮细胞的P-选择素，此外，乳腺癌细胞还通过其自身表达P-选择素上调血管生成因子(TP)。乳腺癌细胞的这种调节机制显然更有利于其浸润和转移。
　　2　CD44

　　CD44是近年来研究较多的一种重要黏附分子，其表达产物为细胞膜表面的糖蛋白，其中CD44v6被认为与多种恶性肿瘤的浸润转移密切相关[3]，其在乳腺癌的浸润转移中具有重要作用，所以备受关注。现就P-选择素和CD44与乳腺癌的研究进展综述如下。
　　2.1　CD44的分子结构及生物功能

　　2.1.1　CD44的分子结构：人CD44是Dalchau等[16]于1980年用单克隆抗体技术检测并初发现。CD44是一种跨膜性糖蛋白，为一组重要的但尚未归类的黏附分子。人CD44基因定位于11号染色体短臂上，按所含外显子的不同分为两种类型：一种是标准型CD44(CD44S)，仅含组成型外显子编码的氨基酸序列，而不含有任何V区变异型外显子，分子量为80～90 kDa。另一种是变异型CD44(CD44v)，CD44v基因含有变异性拼接外显子，目前已发现有十几种CD44v。CD44v的外显子可以是连续式拼接，也可以是跳跃式拼接。参加拼接的V区外显子可多可少，从而产生了不同大小的转录产物，CD44v的分子量可达80～230 kDa[17]，CD44v6与CD44S基本结构相似，只是在细胞膜外区插入了34个由v6拼接型外显子所编码的不同序列氨基酸残基。
　　2.1.2　CD44的生物功能：CD44s广泛分布在正常人体内，主要在间质和造血源性细胞表达，在淋巴细胞和成纤维细胞表面均能检测到。CD44s介导淋巴细胞的活化、分化、回流、黏附等一系列过程。CD44v主要表达于上皮源性细胞、内皮细胞、激活的淋巴细胞和近年发现的多种肿瘤细胞上。作为分布广泛的粘附分子，CD44分子是细胞与细胞、细胞与基质相互识别和作用的分子基础，由于CD44肽链N端可结合透明质酸，故CD44也被视为透明质酸的受体。其主要功能是：①参与细胞间、细胞与ECM的粘附;②介导淋巴细胞与血管内皮细胞的结合，使其穿过血管壁，在血液和淋巴液间运行、并将淋巴细胞归还到淋巴组织(淋巴细胞归巢)，故CD44又称归巢受体(lymphocyte homing receptor);③调节免疫功能，参与淋巴细胞的激活过程;④能与细胞骨架蛋白结合，参与细胞的伪足形成;⑤促进细胞迁移，包括肿瘤细胞的迁移运动。
　　2.2　CD44与乳腺癌转移

　　2.2.1　CD44与肿瘤转移：近年来发现，CD44分子在许多肿瘤都有异常表达，Kim等[18]认为CD44与细胞外的透明质酸相互作用对于结肠癌细胞的侵袭性生长至关重要。CD44蛋白连接细胞外基质及其基底膜透明质酸，使肿瘤细胞将自身锚定在宿主组织的细胞外基质或基底膜上，进而发生侵袭。Hofmann等[19]用notherm印迹法在20多个人癌细胞系中，发现许多肿瘤细胞表达CD44v。应用免疫组化的方法在一组肺肿瘤的研究发现，CD44v6在肺癌组织中表达显著高于癌旁组织，其高表达与临床病理分期呈显著正相关，有淋巴结转移组显著高于无转移组。此外，还发现在非小细胞肺癌中表达显著高于小细胞肺癌。Liu等[20]应用免疫组化检查了胃腺癌和结肠直肠腺癌各62例，CD44v6只在癌组织中表达，CD44v6的高表达与病理分级、浸润程度和淋巴结转移有关。Yamamichi等[21]进一步对CD44v在多种脏器恶性肿瘤的研究认为CD44v5、CD44v6的表达与肿瘤进展程度、转移及预后关系密切。有研究表明CD44v6与多种恶性肿瘤的转移密切相关，可作为评价肿瘤患者预后的重要指标[3]。然而Skmen等[22]发现结直肠癌细胞CD44v6的表达与其复发和转移无关。
　　关于CD44与肿瘤转移的关系，Stella等[23]在研究57例人类黑素瘤原位癌的活组织时，发现57例患者中有56例都在细胞膜上表达了CD44s，但是没有检测到CD44v(包括CD44v3和CD44v6)的表达。Gunthert等[24]发现无转移能力的大鼠胰腺癌细胞只表达CD44s，而不表达CD44v;有转移能力的癌细胞可同时表达CD44s和CD44v，但后者比前者高10倍。将CD44v的cDNA转染非转移癌株模型鼠，发现癌细胞获得了转移能力。认为肿瘤转移可能与CD44s和CD44v的表达失衡有关。CD44s丢失提示细胞间黏附能力减弱，恶性瘤细胞易于浸润。也有提出肿瘤细胞表达的过量CD44与间质的透明质酸相互作用促使其扩散。
　　2.2.2　CD44与乳腺癌转移：有文献报道，CD44s和CD44v6在乳腺导管内癌呈阳性表达，而两者在正常乳腺组织都不表达，两者的阳性表达与乳腺癌的浸润和淋巴结转移有关，CD44v6的高表达与细胞分化有关。Sinn等[25]的研究表明，CD44v6表达与乳腺癌组织学分级有关，伴有腋淋巴结转移的乳腺癌组织CD44v6表达明显高于无腋转移的乳腺癌组织。研究显示，CD44V6在乳腺癌中的表达与淋巴结转移呈正相关，与预后呈负相关， CD44v6是一个独立于大小、分期、淋巴结转移等的较好预后指标。关于标准CD44s在乳腺癌中的表达，有研究表明CD44s在乳腺癌中的表达率为40%，与正常乳腺组织相比，乳腺癌CD44s表达上调，但CD44s的表达与患者年龄、肿瘤的大小与分期、淋巴结转移状态、肿瘤DNA含量、激素受体、SPF(S-phase fraction)等均无统计学相关[26]。
　　Kopp等[27]对伴有或不伴远处转移的乳腺癌患者血清的CD44v6含量进行检查发现，转移患者CD44v6均值显著高于健康者和未转移者。然而 Lopez等[28]甚至认为CD44分子的高表达在乳腺癌的发展中起到阻止和减少浸润及转移的作用。Diaz等[29]进一步通过试验证实CD44分子的高表达可以增加淋巴结阴性的进展期乳腺癌患者的生存率。由此可见乳腺癌中CD44的表达与淋巴结转移和预后之间的关系仍有争议，仍需进一步阐明。
　　3　P-选择素、CD44与乳腺癌转移

　　尽管大量的研究结果证实，P-选择素、CD44作为重要的粘附分子促进了恶性肿瘤的播散，但两者相关性的探讨报道很少见。Tesarova等[30]发现乳腺癌患者的血清中可溶性粘附分子E-选择素、P-选择素、CD44s和ICAM-I是增高的。Hanlev等[31]研究发现在结肠癌细胞系LS174T细胞表面的CD44V是一个类似P-选择素配体PSGL-1的功能性配体，能与P-选择素结合，认为这种选择素与配体结合促发肿瘤转移的作用关键是CD44V的过度表达。所以P-选择素、CD44在恶性肿瘤的转移扩散过程中无疑起着十分重要作用。但P-选择素、CD44是否共同参与了乳腺癌的浸润转移，及其相互作用机制还有待于进一步深入研究和阐明。
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