不同参数对诊断超声联合微泡下肿瘤血管通透性影响的研究

        近年来，国内外研究表明诊断超声所介导的超声靶向微泡破坏技术( Uitrasound-targeted microbubblee destruction，UTMD)可通过提高肿瘤组织血管通透性，从而有效增加病变区药物有效治疗浓度，或可成为提高肿瘤化疗效果的新手段。影响UTMD技术效果的因素是多方面的，包括造影剂微泡剂量、超声输出强度、超声频率、造影剂注射方式、超声波辐照方式、超声辐照时间等，同时各因素间还可能相互制约。为了晟大程度的提高肿瘤血管通透性，还需要对影响其效果的主要参数进行系统研究，可以为下一步深入实验及临床研究提供可靠参数。基于此，本研究使用低频诊断超声联合商业化的SonoV ue超声造影剂微泡对大鼠皮下移植瘤进行持续辐照，主要探索MI、超声辐照时间及微泡剂量对肿瘤血管通透性的影响，从而为优化低频诊断超声联合微泡的影响参数提供实验依据。

        资料与方法

        1.实验动物和癌株

        清洁级SD大鼠132只，雌雄不拘，体质量100-120 9。出生2周的Wistar雄一眭幼鼠1只，体质量62 9，供瘤株形成腹水传代使用。均由我院实验动物中心检疫并提供。 大鼠RH-35肝癌细胞株购自上海生物工程股份有限公司，培养RH35细胞株浓度至1×10／ml后，取1ml细胞悬液注人Wistar大鼠腹腔．1周后抽取癌性腹水，以1 200 r/min速度离心5 mln后弃上清液，将下层浓缩的瘤细胞悬液约。．l ml接种于SD大鼠右腿皮下，共接种132只。接种5d后超声观察，当肿瘤长至l 5 cm左右时用于实验。

        2．主要仪器与材料
        采用Sicmens S2000超声诊断仪，选择9L4探头(8 MHz)进行超声定位与造影检查，选择4Pl探头(1. 75 MHz)进行持续超声辐照；DU800紫外分光光度计（贝克曼公司，德国）；//O戊巴比妥钠溶液；2蹦伊文氏蓝( EB，购自美国SI(;MA公司)；bonovue超声造影剂，实验前以5 ml生理盐水溶解}甲酰胺（分析纯）溶液。

        3.实验分组
        为了探索不问MI、辐照时间、微泡剂量对肿瘤血管通透性的影响，实验共分3部分。 第1部分探索不同辐照时间对肿瘤血管通透性的影响，依据超声辐照时间的不同分为：对照组。、1、3、5、7、iO min及15 min组，Ml为1 3，静脉推注300 vl/kg的sonovue超声造影剂。将实验功物以随机分组方法分为7组，每组6只。 第2部分探索不同Ml对肿瘤血管通透性的影响，依照超声MI的不同分为：对照组M1 0、MI0 l、MI 0 4、MI 0 8、Ml 1 0、MI l.1、M1 1.2及M1l.3组，超声辐照肿瘤组织10 min前经静脉注射300ul/kg的SonoVue超声造影剂。将实验动物以随机分组法分为8组，每组6只。 第3部分探索不同微泡剂量对肿瘤血管通透性的影响，依据实验时微泡剂量的不同分为：对照组0、30、60、iOO、200、300 Vl/kg及400 Vl/kg组，均以MI为1 3的超声辐照肿瘤组织iO min。将实验动物以随机分组方法分为7组，每组6只。

        4．实验方法

        (l)使用Z蹦的戊巴比妥钠30 mg/kg对SD大鼠皮下移植瘤模型腹腔注射，麻醉成功后仰卧于自制手术台上，使用硫化钠溶液在肿瘤局部脱毛建立超声辐照声窗。选用S2000超声诊断仪9L4探头观察大鼠皮下移植瘤，显示佳肝脏超声影像。
         (2)选择S2000超声诊断仪4Pl探头介导超声靶向微泡破裂技术，经静脉缓慢推注50 mg/kg剂量的EB溶液，后团注相应剂量的SonoVue超声造影剂，并追加0 5 ml生理盐水冲管，将实验动物按相应分纽给予相应处理。 (3)将实验动物给予相应处理1h后打开胸腔，将自制输液器自左室插管进入主动脉，灌注含肝素钠的生理盐水100 ml[压力为160-180 cm H2O，(lcm H2O=98 Pa）]，确保从剪开的右心房流出的液体变为澄清为止，随即剥离皮下移植肿瘤组织。 (4)使用电子天平称重肿瘤组织块，剪成小碎块后浸入10 ml甲酰胺溶液中，于37℃恒温水浴箱中孵育24 h，提取肿瘤组织中的EB，以3 000 r/min速度在低温高速离心机中离心5 min，用DU800紫外分光光度计测定离心后的上清液在620 nm大吸收峰处的光密度值。根据求得的EB溶液一光密度值标准陆线可求得淬取液的EB浓度，将EB渗出量除以肿瘤质量即得到单位瘤组织中的EB含量，作为恒量各实验组肿痛血管通透性的指标，从而分析不同处理方法对肿瘤血管通透性的影响。

        5.统计学分析

        使用SPSSl3. 0统计学软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差表示，各实验组单位肿瘤组织EB渗出结果比较采用单因素方差分析，各组间比较眦P<0. 05为有统计学差异。

        结 果

        1．SD大鼠皮下移植瘤模型建立及实验完成情况
        120只SD大鼠皮下接种浓缩肿瘤腹水1周后均建模成功．成功率为iOO%，无自发消退现象发生。建模成功的大鼠模型在实验过程中困麻醉意外、推注试剂速度过快、混入空气栓塞等原因致死12只，终成功完成108次实验，成功率达90%。

        2．不同实验组大鼠肿瘤组织EB含量检测 (l)超声强度对肿瘤血管通透性影响不同等级MI超声联合微泡刑肿瘤组织辐照下肿瘤组织中EB含量，见表1，结果显示当超声输出强度MI≥0 4时肿瘤组织中EB含量明显增加，且随着MI的增长，肿瘤组织中EB含量也随之增加，各实验组与对照组差异均有统计学意义(P<0.05)，当Ml为1.3时达到大值。

(2)超声造影剂剂量对肿瘤血管通透性影响不同剂量超声造影剂下诊断超声联合微泡辐照肿瘤组织下肿瘤组织中EB含量，见表2，结果显示随着超声造影剂剂量的增长，肿瘤组织中EB含量呈线性增加，各实验组与列照组差异均有统计学意义(P<0 05)，当微泡剂量为300pVkg时肿瘤组织中的EB含量达到大值。

(3)超声辐照时间对肿瘤血管通透性影响不同超声辐照时间下诊断超声联合微泡辐照肿瘤组织下肿瘤组织中EB含量，见表3，结果显示随着超声辐照时间的增长，肿瘤组织中EB含量呈线性增加，各实验组与对照组差异均有统计学意义(P<0 05)，当辐照时间为io min时肿瘤组织中的EB含量达到大值。

伊文氏蓝( EB)由于进入血液系统后能够迅速与血液中的白蛋白进秆结合，白蛋白是相对分子量为67 000的大分子物质，正常情况下不能透过肿瘤血管内皮细胞，所以，使用与白蛋白结合的EB作为示踪物质，根据EB是否穿过肿瘤血管壁进入到组织被广泛用于评估血管通透性变化情况。本课题组前期实验使用频率为1 75 MHz、M1为l.4的超声波联 合0 2 rnlikg的“脂氟显”超声微泡辐照局部肿瘤组织5 min，可以明显提高肿瘤组织的EB含量，说明了诊断超声波介导的超声微泡破裂可引起了血管肿瘤屏障的开放或损伤，从而使大分子物质能够穿过血管到达肿瘤组织中。 近年来，国内外研究表明超声治疗仪通过发射超声波介导的超声靶向微泡破坏技术( UTMD)可通过提高肿瘤血管通透性，从而有效增加病变靶区的药物有效治疗浓度，或可成为提高肿瘤疗效的新手段。汤庆等使用照射条件为频率i 9 MHz，TIS 0 8，ISATA 80 rnW/cmz的超声治疗仪持续辐照5 mln．并经尾静脉输入400 ul/kg的sonoVue超声造影剂可增加肿瘤癌组织微血管通透性。Bekeredjian等发现使用频率为1 3 MHz，MIl_6的诊断超声联合1 mL微泡辐照肿瘤15 min可明显提高肿瘤癌微血管的通透性。文献所报道应用UTMD技术进行实验的参数各不相同，分析差异产生的原因可能因为：(l)发射超声波的相应频率不同，文献研究发现不同频率超声波所引发的生物学效应完全不同，可能存在着声压阈值的不 同；(2)应用的超声造影剂不同，可能使超声强度与其产生的生物学效应形成一定的差异；(3)超声波的输出功率完全不同，文献报道的超声治疗仪型号及品牌差异很大，输出功率在瓦级水平，而本研究使用的临床超声诊断仪器输出功率在毫瓦级，产生的生物学效应必然会完全不同lⅢ。对影响诊断超声联合微泡下产生生物学效应的相关因素进行研究，可以为下一步深入实验及临床研究提供可靠参数。
        基于此，本研究使用低频诊断超声联合微泡对大鼠皮下移植瘤进行持续辐照，主要探索MI、超声辐照时间、微泡剂量对肿瘤血管通透性的影响，从而为优化低频诊断超声联合微泡的影响参数提供实验依据。 实验部分主要探索不同MI对肿瘤血管通透性的作用。相关文献表明引发超声空化效应的强度与其所致的生物学敞应之间存在较好的相关关系，本实验所使用的诊断超声中使用机械指数(MI)这一指标反应超声仪所引发的超声强度，由于超声波经皮肤及软组织后的声衰减未纳人相关测量计算中，面且根据超声波在软组织中传播时声压与频率及机械指数的关 系P—wn二√f所示声压与MI和频率呈正比，故机械指数能否真正的反应所引发的超声空化强度仍未可知。本实验使用MI作为反应超声输出功率的主要指标，袁1显示Ml≤0 8时EB的渗出量与对照组无明显差异，当Ml≥0 8时随着超声能量的进一步提高，EB含量由M1—0 8时的(310±28. 31) ygig增加至MI-1-3时的(722. 6±54. 19) /c9/9，差异有明显的统计学意义。

        通过本研究的结果说明，MI超过0.8时可明显增加超声的空化效应，随着MI升高其所引起的血管通透性增加也越明显，因为本实验所使用S2000超声诊断仪器在l_75 MHz条件下输出大M1为l.3条件，未能对MI>l.3情况进行探索。 实验第二部分主要探索不同等级超声造影剂剂量对肿瘤血管通透性的作用。目前相关研究认为，在超声场中注入微泡造影剂相当于加入超声空化核，会使超声空化效应闽值明显降低，可达到增强空化作用的目的。本实验中使用SonoVue超声造影剂注人血液作为超声空化核，表2显示单纯超声辐照对肿瘤血管通透眭未产生明显影响(与对照组相比P>0. 05)，在。-300 vUkg范围内，肿瘤组织EB含量随微泡剂量成线性增加，由30 uUkg的(178. 6土29. 66) t/gjg增加到300 VUkg的(722 6±54 19) yg/g，当微泡剂量>300 FLUk9时EB含量增加不明显，在此处曲线出现高剂量时的平台现象，提示诊断超声联合微泡增加肿瘤组织中的EB剂量有佳剂量效应，当造影剂微泡剂量低于虽佳剂量时随着剂量的增加血管通透性亦随之增加，微泡剂量处于佳计量值时血管通透性也达到大程度，当微泡割量高于佳剂量时血管通透性不做相应增加，可能是因为超声波穿过软组织时散射和屏蔽效应只能和300 UUkg产生协同作用。

        实验第三部分主要探索不同超声辐照时间对肿瘤血管通透性的作用。表3显示超声辐照时间在10m-n范围内随着辐照时间的延长，肿瘤组织中EB的渗出量呈线性增加，由l min的(368. 1±40. 99)vg/g增加到10 min的(722. 6±54. 19) ug/g，诊断超声联合微泡辐照肿瘤组织1 min时，即可使肿瘤组织中EB含量明显增多(与对照组相比P<0. 05)，这是因为触发声孔效应所需的时间很短，l min时间内即可引起超声所致空化效应明显增加，随着超声辐 照时间的延长，肿瘤组织中EB含量也随之增多。当辐照时间超出iO min后EB含量增加缓慢，提示诊断超声联合微泡增加血液中EB渗出在10 min达到撮大水平，在此处曲线出现长时间辐照时的平台现象，此后超声辐照时间对通透性影响不大。可能是因为10 min后超声造影剂经过体内代谢和超声爆破作用后，残留血管内的数量有限，所产生空化效应不足以使血管通透性改变的原因所致。

        文献报道影响超声联合微泡提高血管通透性的影响因素，包括造影剂剂量、超声强度、遣影剂注射方式、超声频率、超声辐照方式（持续辐照和间歇辐照，辐照时间为前次爆破后采用低机械指数实时造影观察到再充盈时间）、超声辐照时间等，同时各影响因素间还可能存在相互制约的关系，对其进行优化可大程度提高肿瘤微血管通透性。在本研究中以大鼠 皮下移植肝癌模型作为实验对象，在皮下移植瘤部位通过固定频率为1 75 MHz的高机械指数诊断超声波刑咀“团注”方式注射进入血管的SonoVue超声造影剂进行持续靶向破坏，以EB在肿瘤组织的渗出量作为考察肿瘤微血管通透性的指标，分别考察了超声造影剂剂量、辐照时间、超声辐照强度即输出机械指数对肿瘤血管通透性的影响，结果发现肿瘤组织血管 通透性的增加随着超声辐照时问、造影剂剂量以及Ml增加而增加的，当辐照时间超过10 min或造影剂剂量超过300 Vlikg时，肿瘤组织中EB含量增加不明显。 
        本实验研究结果表明诊断超声介导的UTMD技术可显著提高肿瘤微血管通透性，超声辐照时间、造影剂剂量以及MI均为影响此技术的主要因素，但仍存在许多问题亟待解决。首先，本实验仅对诊断超声靶向破坏微泡条件下肿瘤血管通透性进行定量评估，但药物或基因只有作用于病变部位的细胞水平才能发挥其应有曲治疗作用，对治疗效果进行评估可为此技术应用于临床提供更为精确的结果。

        其次，我国原发性肝癌多伴有乙肝、肝硬化等前期病变，肝脏肿瘤局部部位血窦会发生“毛细血管化”并有周围肝组织纤维化的发生，本实验仅探索低频诊断超声靶向破坏微泡对皮下移植肿瘤血管通透性的影响，对肝纤维化、肝硬化病变时血管通透性影响还需进一步研究。

        结 论

        低频诊断超声在超声频率为1 75 MHz、M1为1 3、辐照时间为IO min参数下联合300pVkg的SonoVue超声造影剂对肿瘤组织进行持续辐照可以摄犬程度的安全、有效地增加肿瘤血管通透性，超声辐照时间、MI、造影剂剂量均为影响UTMD技术提高血管通透性的主要因素，可为进一步研究低频诊断超声联合微泡实施靶向给药治疗提供实验基础。