SRF在胃癌细胞中的表达及意义

        胃癌是常见的恶性肿瘤之一，其预后差，严重威胁了人们健康。因此胃癌的早期诊断及治疗一直是胃肠道肿瘤防治的重点和热点问题。胃癌细胞中血清应答因子( serum response factor．SRF)是一个重要的转录因子，调控涉及细胞增殖、迁移、分化、血管发生和凋亡等多方面。近研究-1。纠发现其在肝癌、大肠癌等组织中高表达，可能参与肿瘤发生及发展。 本研究利用RNAi技术沉默胃癌SGC-7901细胞SRF基因，从而探讨SRF与胃癌发生及发展的关系，为临床上胃癌早期诊断和治疗提供靶点。

        1 材料与方法

        I.I材料
        主要试剂、仪器及细胞株：SRF（sc-335）抗体购白美国Santa Cruz公司；SABC免疫组织化学染色试剂盒购白武汉博士德公司；siRNA购白上海吉玛制药技术有限公司；RNAi-Mate转染试剂购白上海吉玛制药技术有限公司；Epic:s XLⅡ型流式细胞仪购白美I司Bec:kman Coulter公司。SGC-7901胃癌细胞株购白中国科学院上海细胞库。
        1.2方法
        1.2.1 siRNA的设计与转染 根据SRF的mRNA序列，南上海吉玛制药技术有限公司设计并制作相应的4条siRNA，各组基因序列见表1，常规细胞转染。空白对照组：未经转染（不加入siRNA和转染剂）。转染组：加入针对SRF的siRNA及转染剂siRNA-Mate。转染对照组：仅加入与转染组等剂量的转染剂siRNA-Mate。阴性对照组：加入针对阴性对照的siRNA及转染剂siRNA-Mate。

        1.2.2 Real-time PCR法检测mRNA的含量 常规Trizol提取细胞RNA，按照M-MLV逆转录酶试剂盒说明书进行cDNA的合成，常规Real-time PCR法进行基因合成，GAPDH作为内参。以标本扩增的CT值和标准曲线得ff1各组所检日的基因SRF mRNA的相对拷贝数，将各检测基因与内参基因GAPDH相对拷贝教比较，对比值进行统计学处理，并计算沉默效率（沉默效率=1-实验组比值／空白对照组比值xl00%）。

        1.2.3CCK-8法检测增殖情况 将常规培养的细胞株制成细胞悬液，加入96孔培养板中，lx104/孔，37 0C培养箱中培养至次融合，同步化24 h，按照实验设计分组，10孔／组；依照前述方法转染siRNA，37 0C培养箱中培养48 h，加入10¨L／孔CCK-8，37 0C培养箱中培养3h，用酶标仪测定450 nm吸光度值，并计算抑制率(抑制率=1-实验组OD值／空白对照组OD值×)。

        1.2.4 Western blot法检测SRF蛋白的表达 取生艮状态良好，处于对数生长期的细胞，冷PBS洗涤2次，使用RIPA试剂常规方法提取细胞蛋白。常规West-ern blot法检测细胞中SRF蛋白的表达，|3-actin为内参照。对条带进行扫描，经Image J v2.1.4.7图像分析软件测量条带的OD值，各组目的蛋白经内参平衡（日的蛋白0D值／内参蛋白0D值）后，采用与对照组昀比值作为该蛋白的相对表达量。 

        1.2.5流式细胞术检测细胞周期 细胞转染48 h后，常规胰酶消化，PBS洗2次，制备单细胞悬液，调整细胞密度至lx106/mL。用70%酒精4℃同定过夜，离心弃上清，PBS漂洗3次。加入400 μL PI染液，避光染色30 min。流式细胞仪检测，MultiCyc:le软件分析细胞周期比例。

        1.3统计学分析

        采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。计量资料以x+s表示，各组间采用方差分析，进一步两两比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

        2 结果
        2.1 胃癌SGC-7901细胞siRNA-SRF的转染效率 转染带荧光标记的siRNA经荧光艟微镜观察，80%以上的细胞表达绿色荧光（图1），转染效率约80%。

        2.2 siRNA-SRF对胃癌SGC-7901细胞mRNA表达的影响 Real-time PCR检测结果刊j，对胃癌SGC-7901细胞株给予siRNA-SRF干扰后，4条siRNA均能下调SRF mRNA的表达，对照组siRNA-SRF-900、siR-NA-SRF-901、siRNA-SRF-1107、siRNA-SRF-1649分别力56.4%、36.4%、25.0%、53.6%，相应的沉默效率分别为43.6%、63.6%、75.0%、46.3%，差异有统计学意义(F=66.042，P<0.05)。转染对照组、阴性对照组表达水平分别为94.5%、93.7%，差异无统计学意义(P>0.05)，其中siRNA-SRF-1107基因沉默效率高(75.0%)。因此选用siRNA-SRF-1107进行后续实验研究。

        2.3 siRNA-SRF对胃癌SGC-7901细胞SRF蛋白表达的影响 　　

Western blot检测vi/J\(图2)，予以siRNA-SRF-1107干扰后，转染组的SRF表达水平明下调(40.1%)，差异有统计学意义（F=142.735，P<0.05）。而转染对照组和阴性对照组表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。 　　

        2.4 siRNA-SRF对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响 转染48 h以后，空白对照组、转染组、阴性对照组和转染对照组的OD值分别为1.784+0.326、0.638+0.170、1.738+0.26I和1.663+0.141。转染入siRNA-SRF-1107后，SGC-7901细胞株增殖明艟受限，抑制率为64.24%，与空白对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。阴性对照组和转染对照组写空白对照组比较，细胞增殖抑制率分别为2.58%和6.78%，差异无统计学意义(P>0.05)。

        2.5 siRNA-SRF对胃癌SGC-7901细胞周期的影响 转染48 h后，流式细胞仪检测空白对照组、转染组、阴性对照组和转染对照组细胞周期(表2，图3)。空白对照组、阴性对照组和转染对照组在Co/C1,、S、G2/M期百分比方面差异兀统计学意义( P>0.05)。而转染siRNA-SRF-1107后，SGC-7901细胞株Co/C1 ，期百分比明娘增加(P<0.05)，提示其被阻滞于Co/C1期。 

        3 讨论
        胃癌是常见的消化道肿瘤之一，其发病率及病死率高。且早期诊断困难，缺乏合理评估预后和治疗效果的分子生物学指标，因此对胃癌发生、发展机制的研究，尤其是特异性分子生物学指标的寻找，一直是临床关注的热点和难点问题之一。 SRF属于MADS盒家族的转录因子随1，近研究发现其在肝癌、大肠癌、甲状腺癌等组织中高表达，可能参与肿瘤的发生、发展及侵袭、转移。关于SRF与胃癌发生、发展关系的研究同前鲜见报道。本实验主要探讨SRF与胃癌发生及发展关系，为临床卜胃癌 的早期诊断及治疗提供靶点，采用RNAi技术沉默胃癌SGC-7901细胞株SRF基因，Western blot结果显示转染组SRF蛋门表达水平昆著降低。应用针对SRF的siRNA能够昆著下调胃癌SCJC-7901细胞株中SRF mRNA和蛋白水平的表达。 作为转录因子，SRF在调控细胞分化和细胞周期进程方面发挥着熏要作用。

        有研究表明在肝癌细胞株，采用过表达技术卜调SRF的表达，能够使细胞获得间质细胞表型，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。而使用RNAi技术沉默SRF则引起相反效应，细胞增殖受抑。有研究表明SRF是促进细胞增殖的间接调控因子，而在不同类型或不同来源细胞中，SRF对增殖调控作用不尽相同，在心血管、骨骼肌和平滑肌来源细胞中SRF mRNA表达的上调多提示SRF具有促进分化和增殖的效应。本研究选择沉默效果高的siRNA-SRF-1107，有效T调SRF在胃癌SGC-7901细胞株mRNA和蛋『L|的表达水平。利用CCK-8法检测细胞增殖情况，发现转染组细胞增殖明湿受抑，而阴性对照组和转染对照组对细胞增殖无影响，进一步提示设计的siRNA特异性和靶向性强，采用的脂质体转染法对细胞增殖无影响。同时 使用流式细胞术检测细胞周期，发现转染组细胞被阻滞在Co/C1期，提示SRF可能调控SCC-7901细胞周期，与胃癌细胞增殖密切相关。

        综合所述，SRF可以通过调控细胞周期从而促进胃癌发生及发展，采用RNAi技术沉默SRF基因能够使胃癌SGC-7901细胞产生周期阻滞作用，使细胞周期阻滞在Co/C1期，抑制胃癌SCC-7901细胞的增殖。本实验为胃癌早期诊断及治疗提供了新的靶点，对于胃癌早期诊断及治疗具有指导意义。