毛细管电泳技术在分析胎儿脐血血红蛋白中的应用

        人类珠蛋白基因的表达具有时空顺序性。α-珠蛋白基因簇和β-珠蛋白基因簇的表达各具特点：α-珠蛋白基因簇中的§-和ε-珠蛋白基因在胚胎卵黄囊中表达，妊娠10周前完全关闭，α-珠蛋白基因从妊娠第5周开始表达并持续至终生;β-珠蛋白基因簇中的γ-珠蛋白基因也从妊娠第5周开始表达但在出生前后开始关闭，β-珠蛋白基因在胎儿期处于低表达状态，出生前后表达逐渐增多并持续至终生[1]。
        因此，胚胎期的主要血红蛋白为：Hb Gower 1(§2ε2)、Hb Gower2(α2γ2)和Hb Portland(§2γ2);胎儿期及新生儿期主要为HbF(α2γ2)，还有少量HbA(α2β2)和微量HbA2(α2δ2);成人期血红蛋白组成为：HbA(α2β2)：96.5%～97.5%，HbA2(α2δ2)：2.5%～3.5%，HbF(α2γ2)：0%～1.0%。本文利用毛细管电泳技术对中晚孕胎儿脐血进行血红蛋白电泳，分析不同孕周胎儿脐血血红蛋白的组成及含量，为胎儿地中海贫血和异常血红蛋白病的诊断提供临床参考资料。 
        1材料与方法 
        1.1研究对象：收集2010年4月～2013年5月期间，在我院产前诊断中心行B超引导下脐静脉穿刺术，并剔除夫妻双方或一方确诊或可疑为地中海贫血的孕妇共425例。胎儿孕龄22～37+6周，详见表2。可疑地中海贫血的判定标准：①MCV低于82.0 fl;②MCH低于27.0 pg;③HbA2低于2.5或高于3.5，只要满足其中1条即判定为可疑病例。 
        1.2研究方法

        1.2.1超声引导下经腹胎儿脐静脉穿刺术：孕妇排空膀胱，取仰卧位，低流量吸氧，B超测量胎儿生长指标、羊水深度、胎盘位置及厚度、胎心率等。对孕妇腹部常规消毒铺巾后，选用22GPTC穿刺针，在B超实时监测下行胎儿脐静脉穿刺术，抽取脐静脉血1 ml送检。术毕，动态观察胎心率约1 h。 
        1.2.2脐血血红蛋白毛细管电泳分析：采用法国Sebia公司生产的Capillarys 2全自动毛细管电泳仪及其配套血红蛋白电泳试剂盒。按照仪器操作说明书进行，EDTA抗凝标本直接离心取红细胞层样本18μl加入装有90μl溶血素的稀释杯中。再将装有标本的试管按顺序放在仪器配套的检测架上(一个检测架一次一批可检测7个标本，可同时检测多批标本)，在检测架第八管位置加入大约4 ml CAPILLARYS HEMOGLOBIN(E)溶血液。把检测架送入        Capillarys 2全自动毛细管电泳仪进行血红蛋白电泳检测，约30 min后全部检测程序完毕，查看结果。质控品购买第三方的NORMAL HbA2 CONTR，随标本检测。 
        1.3统计学方法：采用SPSS 19.0统计分析软件包，统计分析采用方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果

        2.1 425例胎儿脐静脉血样本血红蛋白由HbA和HbF组成，未发现其他类型血红蛋白。HbA含量间于2.3%～18.0%，平均6.80%，标准差1.96%;HbF含量间于82.0%～97.7%，平均值93.18%，标准差1.95%。见表1。 
        2.2按胎儿孕龄对所有425例样本进行分组，统计各组胎儿脐静脉血血红蛋白各组分百分含量。结果显示：随着胎儿孕龄的增加，脐静脉血中HbA的百分含量逐渐增多，HbF的百分含量逐渐减少，具体结果见表2及图1、图2。经单因素方差分析(ANOVA)检验，各组之间HbA百分含量的差异具有统计学意义(F值=25.863;P=0.000)，各组之间HbF百分含量的差异也具有统计学意义(F值=26.190;P=0.000)。 
        3讨论

        本文利用全自动毛细管电泳仪分析胎儿脐血血红蛋白组分和含量。与琼脂糖凝胶电泳相比，全自动毛细管电泳能更准确的区分HbA，HbA2，HbF，HbH，HbBart′s，HbCS各条带的百分比，且具有样品处理简单、自动化程度高、检测时间短等优势[2]。国外，早至1998年Suthat[3]等人，2000年TongsongT[4]等人相继报道利用高效液相色谱法(HPLC)对HbA值作分析以用作地中海贫血及相关血红蛋白病的诊断。但与HPLC相比，全自动毛细管电泳技术分离、定量Hb更加简单、准确[5]。
        总之，毛细管电泳技术定分辨率高、定量准确、所需样品少，具有快速、高效、敏感、自动化优点，用于胎儿脐血血红蛋白分析更具优势。本文收集的425例脐血样本，孕龄从22周到37+6周，血红蛋白由HbA和HbF组成，未发现其他类型的血红蛋白。HbF含量间于82.0%～97.7%，平均值93.18%，标准差1.96%。与汤丽霞等人利用HPLC技术检测胎儿脐血HbF的报道[6]相比较，HbF的含量基本一致(93.18%与94.5%)，但利用毛细管电泳测的HbF数据标准差大大低于HPLC检测的数据(1.96%与5.6%)，这说明毛细管电泳法更加稳定和准确。本文结果显示，胎儿脐血中HbF的含量大大高于HbA，这说明在中晚孕期，胎儿γ-珠蛋白基因的表达量大大的多于β-珠蛋白基因。在胎儿血液低氧分压的环境中，HbF与氧气结合能力强于HbA，脐血中大量的HbF有利于携带更多的氧气供胎儿组织器官利用，有利于胎儿的生长发育。 
        本文还发现，随着胎儿孕龄的增加，脐静脉血中HbA的百分含量逐渐增多，HbF的百分含量逐渐减少，且各孕龄组之间HbA百分含量及HbF百分含量的差异均具有统计学意义(P<0.05)。这说明在胎儿中晚孕期γ-珠蛋白基因表达逐渐减少，β-珠蛋白基因表达逐渐增多，这可能是在为出生后γ-珠蛋白基因表达逐渐关闭和β-珠蛋白基因逐渐优势表达做准备。
        目前血红蛋白电泳已作为孕中晚期α地贫产前诊断的常规方法，Hb电泳法Hb Bart′s定量分析和基因检测对中间型及重型α地贫的诊断无异，诊断符合率为[7]。此外，Hb电泳还能弥补基因诊断不足，降低漏诊率。在胎儿β地贫的生化诊断方面，也有不少报道。目前国内外多数利用早期绒毛穿刺，孕中期采羊水及孕中晚期抽取脐静脉血作β地贫基因诊断[8-10]，但普遍认为其诊断准确率约98%或更低，还存在漏诊的现象。钟惠珠等[11]用全自动琼脂糖凝胶电泳对75例孕17～36周的胎儿脐血作了研究，得出HbA定量分析对重型及中间型β地贫的检出特异度为，在轻型β地贫，其诊断的敏感性及特异性分别达到85.2%及89.6%。
        可见血红蛋白电泳在地中海贫血的产前诊断中应用广泛，但要产前诊断地中海贫血，了解正常胎儿不同孕周血红蛋白的组成和含量尤为重要。本文建立的各孕周胎儿脐血各血红蛋白含量的参考值范围，为今后应用毛细管电泳技术诊断胎儿地中海贫血和异常血红蛋白病提供了参考依据。由于胎儿期血红蛋白主要为HbF(α2γ2)，成人期血红蛋白组成为：HbA(α2β2)：96.5～97.5%，HbA2(α2δ2)：2.5～3.5%，HbF(α2γ2)：0～1.0%。通过脐血血红蛋白电泳能通过检测HbA2的量而较容易地发现微量的母血污染，从而避免因母血污染而导致基因诊断的误诊问题，在一定程度上避免了基因诊断误诊而给患者带来的不必要伤害。 
        4参考文献 
        [1]张俊武，龙桂芳.血红蛋白与血红蛋白病[M].广西科学技术出版社，2003.

        [2]陈星，卢业成，初德强，等.全自动毛细管电泳与琼脂糖电泳检测血红蛋白的比较[J].广东医学，2009，30(5)：778.
        [3]Suthat F，Premee W，Raewadee WJ，et al.Prental and postnastal diagnoses of thalassemias and hemoglobinopathies by HPLC[J].Clinical chemistry，1998，4(44)：740.
        [4]Tongsong T，Wanapirak C，Sirivatanapa P，et al.Prenatalcontrol of severe thalassaemia：Chiang Mai Strategy[J].P renatDiagn，2000，20(3)：229.
        [5]Keren DF，Hedstrom D，Gulbranson R，et al.Comparison ofSebia Capillarys capillary electrophoresis with the Primus high-pressure liquid chromatography in the evaluation of hemoglobinopathies[J].Am J Clin Pathol，2008，130(5)：824.

        [6]汤丽霞，欧丽群，曾劲伟，等.HPLC测定脐带血HbF正常参考值得建立及对母血污染的评价分析.重庆医学，2011，40(28)：2820.
        [7]杨金玲，蔡稔，韦小妮，等.胎儿巴特(氏)血红蛋白定量分析在产前诊断α-地中海贫血中的价值[J].检验医学与临床，2010，7(12)：1227.
        [8]曾瑞萍，游泽山，胡彬，等.120例胎儿β地中海贫血产前基因诊断分析[J].中华血液学杂志，1999，4(20)：204.
        [9]廖灿，徐湘民，黄以宁，等.反向点杂交法用于产前诊断β-地中海贫血60例分析[J].中华妇产科杂志，1996，31(6)：348.
        [10]Cai SP，Wall J，Kan YW，et al.Reverse dot blot probes forscreening ofβ-thalassernia Mutationsin Asians and Americanblacks[J].Hum Mut，1994，3(1)：59.
        [11]钟惠珠，李坚，魏佳雪，等.胎血HbA定量分析诊断β地中海贫血的价值[J].中国生育健康杂志，2003，14(5)：286.