液体活检，蓝藻？蓝海？

         [关键词] 肿瘤；液体活检；循环肿瘤细胞；循环肿瘤DNA
         [中图分类号]R730
         [文献标识码] A
          DOI:10.12019/j.issn.1671-5144.2016.01.001Liquid Biopsy: Blue - Green Algae or Blue Ocean Strategy?//ZHONG Wrds:neoplasms; liquid biopsy; circulating tumor cells( CTC);circulating tumor DNA( ctDNA)Authors' address: Cancer Center, Guangdong GeneralHospital, Guangdong Academy of Medical Sciences,Guangdong Lung Cancer Institute, Guangzhou 510080, China
         1 引 言
         一百年前，爱因斯坦凭借着超人的洞察力提 出广义相对论并预言引力波的存在，却难以提供证实方法。随着科技飞速发展，汇集了全球 科学家的LIGO (Laser Interferometer Gravitational一wave Observatory)团队在90年代初即开始建立长达4公里的干涉波观测站，用激光编织的巨网、倾 听来自宇宙深处不同方向的引力波信号。同样的百年故事也发生在一批埋首于人体幽微细小处的医学家中。1 869年，澳洲医生Ashworh从一例转移性肿瘤患者血液中观察到从实体瘤脱落人血的 肿瘤细胞，把它命名为循环肿瘤细胞( circulatingtumor cells，CTC)，为其后Paget的“种子土壤学说” 提供了重要依据‘¨。直至1 983年，人类才发现了能够捕获CTC的磁珠。历经20年，CTC检测系统 CellSearch正式获得美国FDA批准用于转移性结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌的临床检测；近30年后的20 1 2年，CeIISearch系统获得CFDA进口器械注 册。敏锐的学者们开始意识到液体活检在肿瘤早筛、辅助诊断、术后随访、疗效评估、耐药监测等方面潜在的巨大临床和科研价值‘2—4]。 
         进入20 1 5年，基因测序行业元年，国家卫计委一系列政策利好。风乍起，吹皱一池春水，起于青 萍之末。风起的池塘，液体活检在资本护持下风 起云涌，会把池塘变成惠及患者的江河蓝海，还是 野蛮失控生长的商战蓝藻池？ 
         2 液体活检的前世今生 
         2015年，MIT Technology Review发布的年度十大突破技术（BreakthroughTechnologies 2015），ASCO年度进展（Clinical cancer advance 2015）中对 未来十年的期许，液体活检均榜上有名。 
         目前液体活检主要通过血液、尿液甚至唾液 等标本，检测包括游离CTC、循环肿瘤DNA( circulating tumor DNA，ctDNA)、／J、分子RNA及 长链非编码RNA等协助癌症诊断。与目前标 准的组织活检相比，革命性的液体活检具有一些理论优势：创伤小、可重复性、均化异质性、 实时判断疗效，并随肿瘤的发展而动态调整治疗决策。 
         由于检测手段的局限性及CTC的极低频，长期以来液体活检并未发挥实质性的作用。从发现CTC至今的一百多年里，科学家像一支不知疲倦的侦察奇兵，即便只是肿瘤细胞路过的遗落信息(CTC)甚至死亡的残骸(ctDNA)，也要探寻出变异密码。这就是目前液体活检技术的两个主要方 向：CTC和ctDNA。 
         虽然CeIISearch系统已在临床上广泛应用，并 被美国国家医保Medicare所认可。但该系统属于 代CTC技术，其缺点在于假阴性率高和难以深度分析。CelISearch系统目前只能计算CTC的数 活检技术的肿瘤患者至少为542万人，占比 量，不能对单个CTC进行包括基因测序、蛋白表 72%。该技术在未来5年至1 年的市场渗透率达、药物敏感性检测等更细致的分析。以肺癌为例，由于大部分肺癌细胞迁移人血的过程中容易出现上皮间质转化，丢失上皮表面粘附分子的表达。而上皮粘附分子又是CeIISearch系统主要的捕获靶标。因此，CelISearch在肺癌中的 CTC检测结果并不尽如人意。为了克服上述缺点，提高CTC检出的灵敏度和发展对捕获和富 集CTC进行后续分析的能力，在研的二代CTC检测采用了多种技术路线。但无论是在技术还是市场方面均处于早期阶段，尚没有统一的标准，目前还很难判断哪一种技术路线将成为行 业标准。 
         另一方面，ctDNA检测也成为临床探索的热点。由于肿瘤特异性的ctDNA并不存在于正常细胞中，他们为癌症检测提供了一种十分敏感和特 异的方法，临床应用的可行性甚至超越CTC。但是 在循环肿瘤标志物中，ctDNA与CTC因其来源不 同、评价标准不同、生物学特征不同，两者可能侧重于不同方面的临床应用。CTC在精确反映肿瘤 细胞血循环微转移申具有显著优势，可以有效评估肿瘤的发生发展状态，因此在早期筛查、辅助诊断、复发监测及疗效评估上具有独特地位。而 ctDNA则更侧重于反应肿瘤细胞内DNA的变异情况，因此其在治疗决策（驱动基因检测）及靶向耐 药监测中发挥重要作用。从技术角度，同时检测 CTC与ctDNA可行，从临床角度，同时检测CTC和 ctDNA所得到的信息可能是互补的。两种液体活检技术共存可能是未来的发展方向。总的来说， 保证特异性前提下的高敏感度、便于临床应用、可重复性好是CTC与ctDNA检测技术的三个重要评 判标准‘3]。 
         3 蓝海：来日之可期
         敏感的投资者和研究者早已捕捉到这一风 向标，海内外液体活检市场加速崛起。JP摩根和 高盛将液体活检细分为早期筛查、诊断分型、药物伴随检测、患者病情监测四个领域，预测市场潜力将达千亿级。这一预测基于大数据提供的时代背景和市场容量。随着测序技术的进步、样本的积累，肿瘤领域的基因测序市场将加速发
展。我国正面临着降低癌症发病率和提高癌症生存率的双重挑战，肿瘤患者中，适合使用液体将达50%。 
         回归到肺癌的诊疗上，液体活检技术已渗透 到肺癌的治疗中：以外周血ctDNA／CTC为材料，进行EGFR突变和ALK触合等治疗驱动性靶点 检测；在EGFR-TKI用药期间，动态监测血浆 EGFR敏感突变的定量变化预测患者疗效；在 EG-FR-TKI耐药患者中，检测血浆耐药基因T790M的浓度以制定后续治疗策略：可以说，液体活检为肺癌的靶向治疗建立了实时、动态、定量的驱 动基因检测体系，与医学的思路契合，潜能 巨大。技术领先的公司如Cx-nV enio、Biocept、 Adaptive Biotechnologies等已经获得了美国FDA第 三方诊断实验室的认可，也显示出监管机构对液 体活检技术临床价值的认可3与此同时，中国 CFDA也批准肺癌CTC检测（靶向PCR CTC） 技术正式应用于临床，将有效应用于早期肺部结节的辅助诊断、手术后复发监测和晚期患者化疗 疗效评估。 
         以Illumina公司为例，融资1亿美元成立新公 司Grail，致力于开发“滴血验癌”的早筛试剂盒。 获得8 000万美元融资成立的Cocliak BioSciences． 竟是以当年6月份在《自然》杂志上发表的成果为基础。新技术从学科刊物到实体经济转化历时仅几个月时间，让人咋舌。 
         不过，争相进入蓝海的热潮里也有冷静声音。技术进步与医保覆盖将是接下来打人这个 市场大的“鸡血”，但恰好这两项也是目前大的制约。由于我国地域广阔，区域间的医疗水平差异很大，医保经费紧张，短期内是不太可 能覆盖这种新检测技术的。另外，该技术还处 于早期阶段，从技术成熟到获得临床证据，转化 成临床实践，终实现其市场潜力还需要5～15年时间。 
         4 蓝藻：未来尚未来
         池塘生春草，园柳变鸣禽。本是春意盎然好时节，但若池塘内是随风潜入夜、悄然野蛮生的蓝藻，将带来生态链的隐忧甚至灾难。蓝藻在铺满水塘前8天，仅占池塘的1/256，细微到无法觉察。 然而，8天时间，1/128、1/64. 1/32. 1/16……的指数扩张，它悄然间占领整个池塘。对于风生水起的液体活检，学界与投资界各怀“蓝藻之忧”         
         20 1 5年9月1 0日，加少f、|公司Pathway Genomics在新闻发布会宣布推CCancerInterceptrM—— 用于高危人群癌症筛查的液体活检试剂盒。而 短短1 0天后，Pathway即遭到美国FDA的警告。在此之后，FDA还叫停了另一家硅谷公司Theranos的 疾病滴血检测服务。 
         缘何吸引眼球的新技术未能得到监管部门的肯定？在肯定液体活检重要意义的同时，我们也 应该看到，新技术在真正步人别临床证据的支持前尚面临诸多挑战。这也是“蓝藻之忧”的第 一个层面：在技术尚未完善和标准化之前，野蛮生 长的产业也许会带来区域性的失控。 
         ，技术层面。基于CTC和ctDNA的驱动基因检测无论在检测技术或基因的动态变化层面均存在众多挑战。首先，多项研究显示，外周血EGFR突变检测具有高的特异性，但敏感性徘徊于50%)~70%，是外周血检测临床应用的瓶颈；其次，目前的研究尚未明确EGFR-TKI治疗过程中敏感 和耐药基因的动态变化规律，比如T790M突变在 不同的生物标本中的状态、何时出现于外周血中 及其诊断阈值，致预防性的第三代抗TKI耐药治疗成为空中楼阁；后，CTC的分选匮乏兼具高敏 感性和特异性的ctDNA/CTC驱动基因分析技术。 
         同样，目前也没有通用的ctDNA特征用于任何阶段或类型的癌症筛查。首先，增加检出灵敏性 的同时也增加了基因杂音的干扰，从而导致了假 阳性的增加；其次，不是所有的癌症都与离散的和一致的早期基因突变有关，很多癌症在疾病的任何阶段以意想不到的方式产生多种突变；此外，不是所有的肿瘤都会以相同的方式向血液中释放ctDNA；后，任何新的诊断检测必须经历临床验证，这是常规获批的必要步骤。 
         第二，医学伦理层面。尚不成熟的技术推向 市场带给大众的是恐慌多于福祉。近年来，肺癌 的流行病学谱已发生了迁移，不吸烟、年轻、女性 患者比例逐年增高。原来单纯以年龄和吸烟状态 作为危险因素定义的依据远远不够。其次是如何取得早筛和过度诊断治疗的平衡。如果我们穷尽 各种检测手段，仍然没有发现可见肿瘤，是否需要对这部分人群进行后续的随访复查？筛查本身 的并发症，患者的精神忧虑和经济负担又如何衡量？ 
         尽管风险重重，诱人前景仍让企业和研究者 对液体活检爱不释手。“若不赶紧跑马圈地，一夜 之间池塘就会被蓝藻占领，再无空间”，这也成为另一种“蓝藻之忧”。回报越高的领域，风险也越 高。据MIT商业评论报道，Foundation Medicine为 了开发体液活检已经花掉了近2亿美元，现在仍 在以每季度数百万美元的速度消耗；其次，20 1 3年美国高法院规定，基因作为一种自然存在的事物，不能被申请专利；现在这一规定已经延伸到了体液活检。巨额的投入，研发的风险，后 也许是失去了专利的保护，给企业提出了更高的 挑战。此时，只有研发出合理的检测手段和运 营策略，才能成为行业的佼佼者。技术仍然成为 整个领域里大的掣肘，同时也是大的催 化剂。 
         5 规范与同行 
         在此，我们必须对FDA的警告拍手称赞。对于临床研究者而言，液体活检这一新技术既是机遇也是风险，需要扶持和宽容，更需要符合伦理、 合理引导、限定范围和有效监管。我们需要在科 学性和商业性、创新实践和规则制约之间寻找平 衡。对前景不明朗的研究方向，研究热情靠什么 支撑下去？是兴趣，以探索未知的好奇心；是合 作，来自不同的专业背景的共赢，促进新技术的良 性循环。 
         期待三月羊城第十三届中国肺癌高峰论坛： “与规范同行：NG-S和液体活检步人临床”。
          [参 考 文 献]
         [1] Paget S.The distribution of secondary growths in cancer of thebreast. 1889[J]. Cancer me[x]tastasis Rev, 1989,8(2):98-101.
         [2] Maheswaran S, Sequist LV, Nagrath S, et al.Detection ofmutations in EGFR in circulating lung-cancer cells[Jl.N EnglJ Med, 2008, 359(4):366-377.
         [3]Zhou C.Blood - ba[x]sed tumor markers in lung cancer [J].Zhongguo Fei Ai Za Zhi, 2015,18( 12):770-780.
         [4] Bai H,Mao L,Wang HS,et al.Epidermal growth factorreceptor mutations in plasma DNA samples predict tumorresponse in Chinese patients with stagesⅢB toⅣnon - small-cell lung cancer [J].J Clin Oncol, 2009, 27 (16):2653-2659.
         [5] Mok T,Wu YL, Lee JS, et al.Detection and dynamicchanges of EGFR mutations from circulating tumor DNA as apredictor of survival outcomes in NSCLC patients treated withfirst -line intercalated Erlotinib and chemotherapy [Jl. Clin Cancer Res, 2015,21(14):3196-3203.
         [6] Pailler E, Adam J, Barthelemy A, et al. Detection ofcirculating tumor cells harboring a unique ALK rearrangementin ALK-positive non-small-cell lung cancer [Jl. J Clin Oncol,2013 , 31(18 ) : 2273-2281.
         [7] Thierry AR, Mouliere F, El Messaoudi S, et al. Clinicalvalidation of the detection of KRAS and BRAF mutations fromcirculating tumor DNA [J ] . Nat Med , 2014, 20(4) : 430-435.
         [8] Newman AM, Bratman SV, To J, et al. An ultrasensitivemethod for quantitating circulating tumor DNA with broadpatient coverage [ J ] . Nat Med , 2014, 20(5) : 548-554.
         [9] Alix-Panabieres C, Pantel K. Challenges in circulating tumourcell research[J]. Nat Rev Cancer, 2014, 14(9) : 623-631.
         [10] Piotrowska Z, Niederst MJ, Karlovich CA, et al.Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-typeclones following treatment of T790M - positive cancers with athird-generation EGFR inhibitor [Jl. Cancer Discov, 2015, 5(7) : 713-722.
         [11] Sundaresan TK, Sequist LV, Heymach JV, et al. Detection ofT790M, the acquired resistance EGFR mutation, by tumorbiopsy versus noninvasive blood - ba[x]sed analyses [J]. ClinCancer Res, 2015 0ct 7. [Epub ahead of print]
         [12] 王洁，张秋怡．循环肿瘤细胞分离及外周血EGFR检测的相关研究分析[Jl.循证医学，2016，16(1)：46-48，52.
         [13] 宋勇，袁冬梅，翟浩然．二代测序在早期肺腺癌的克隆基因改变及晚期肺腺癌的细胞骨架重塑基因研究中的应用 [J].循证医学，2016.16(1)：41-45.