荧光PCR法检测基因突变之反应体系优化

1、引物、探针及blocker浓度

引物的浓度会影响特异性，佳的引物浓度一般在0.1-0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低PCR扩增效率。某些条件下，设置不同上下游引物浓度可提高扩增效率。 探针的浓度会影响扩增效率， 佳的探针浓度一般在0.1-0.5μM。探针浓度过高会造成成本增加、本底信号增加及非特异性产物，过低则降低PCR扩增效率，一般探针浓度低于引物浓度，通常会将探针浓度设置为引物浓度的1/2。

Blocker浓度直接影响PCR扩增的效率及特异性。Blocker作为野生型封闭系统能特异性结合野生型模板从而阻滞特异性引物与野生型模板非特异性结合，此外blocker 3’端修饰基团能封闭序列扩增。如果blocker浓度过低，无法有效阻止野生型扩增，浓度过高则降低PCR扩增效率。Blocker浓度一般高于引物浓度，常见的是引物浓度的1-2倍，具体需要进行优化测试确定。   

2、dNTP浓度

决定低dNTP浓度的因素是靶序列DNA的长度和组成，在PCR反应中，dNTP一般为50～200umol/L，当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等,以减少扩增中由于某种dNTP的不足出现错误掺入。dNTP含有磷酸根，能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低，其浓度变化会影响Mg2+的有效浓度。在高浓度DNA及dNTP条件时，需相应调整Mg2+的浓度。

3、Mg2+浓度

Mg2+影响DNA聚合酶的活性和引物退火等。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子量。佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μM dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM 。较高的游离镁离子浓度可以提高扩增效率，但也会增加非特异性扩增。为了确定佳浓度，从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子浓度优化测试。   

4、PCR反应体积

PCR反应体积一般有10、20、25、40、50、100μL等。体积太小，加样的时候可能会存在加样误差，影响反应结果，体积过小也会影响扩增效率。常见的反应体积为25μL，如果采用多重荧光PCR扩增（三重及以上），可以采用40μL或50μL反应体积。可以综合考虑扩增结果及成本选择佳反应体积。

5、PCR反应条件

在标准反应中采用三步法扩增，双链DNA在高温（90-95℃）变性，再迅速冷却至退火温度（40-60℃），引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至延伸温度（70-75℃），在聚合酶作用下，引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（100-300bp）一般采用二步法，除变性温度外，退火与延伸温度合二为一，即采用高温变性，60℃左右退火与延伸。

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退火温度 退火温度是影响PCR反应特异性与敏感性的重要因素之一。变性后温度快速降至退火温度可使引物与模板结合，由于模板DNA比引物复杂，引物与模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。在Tm值允许范围内，选择较高的退火温度可减少引物与模板之间的非特异结合及引物二聚体形成，提高PCR扩增特异性。目前常见地，荧光PCR退火温度一般设定为60℃，也可以通过逐步提高或降低退火温度以提高特异性和扩增效率。通常以2℃为增量，逐步提高或降低退火温度加以优化测试。

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退火时间 退火时间取决于模板靶序列长度，一般选择30s作为退火时间，某些荧光PCR仪因荧光信号读取有低时间要求，如ABI 7500荧光信号读取时间低为30s。

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PCR循环数 PCR循环数主要取决于模板DNA浓度，循环次数越多，非特异性产物量也随之增加，从而出现非特异性扩增。一般检测PCR循环数在30-45之间，可以根据具体反应体系进行优化，如以40个循环为起点，以5循环为增量进行增加或降低循环数测试优化。