幽门螺杆菌双亚单位基因疫苗的构建及免疫原性研究

【摘要】  目的：构建幽门螺杆菌（Hp）两个保护性亚单位UreB、HspA融合基因疫苗并观察其免疫原性。方法：从Hp基因组分别扩增出UreB、HspA基因片段，采用重叠延伸PCR方法将两个基因片段构建融合基因，以BglⅡ和XhoⅠ酶切位点克隆入真核表达载体pcDNA3.1（+）中，经测序确认后转染COS7细胞，Western blot检测目的蛋白表达，胫前肌注射免疫小鼠后收集血清检测特异性抗体效价。结果：经测序后证实成功将融合基因构建到真核表达载体中，免疫印记检测到目的蛋白表达，并具有良好的抗原性，免疫小鼠后能够产生特异性抗体。结论：成功构建Hp双价DNA疫苗，免疫小鼠后显示出良好的免疫原性，为Hp进一步基因疫苗的研究奠定了基础。

【关键词】  幽门螺杆菌 DNA疫苗 尿素酶 热休克蛋白

　　AConstruction and immunogenicity studies on a fused DNA vaccine with UreB and HspA of Helicobacter pylori

　　YUAN XiaoPeng, ZOU QuanMing, HONG Yu, BAI Yang, WU Chao, ZHANG WeiJun.

　　Department of Clinical Microbiology and Immunology & Chongqing Engineering Technology Research Center of Biopharmaceuticals,the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

　　［Abstract］ob[x]jective:To construct a fused H.pylori DNA vaccine consisting of UreB, HpaA gene fragments, and observe its immunogenicity.Methods:The fragment of UreB and HspA genes was obtained by PCR amplification from H.pylori genome DNA, then the fusing gene UH was obtained by SOE PCR(splicing by overlap extension). UH was subcloned into an eukaryotic ex[x]pression vector pcDNA3.1. Then the fusion protein was identified by Western blot after plasmid pcDNA3.1UH was transfected into COS7 cells and ELISA was used to detect the specific antibody after immunization in mice.Results:The eukaryotic ex[x]pression plasmid of the fusing gene two fragments was constructed,and a novel fusion protein was expressed after transfection into COS7 cell. Specific antibody was found in mouse serum after immunization with the DNA vaccine.Conclusion:A fused DNA vaccine of from H.pylori with good immunogenicity has been successfully constructed, which lay a foundation for further investigation on H.pylori DNA vaccine.

    ［Key words］  Helicobacter pylori；DNA vaccine；UreB；HspA
   
　　幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种全世界范围的人类感染病原菌，对人类健康构成严重危害。Hp中富含的尿素酶B（UreB）、热休克蛋白A（HspA），在Hp疫苗的研究中，在动物保护实验中已经证实具有一定的免疫保护效果，两者共同应用具有比单一抗原更好的保护效果［13］。本实验室在前期的研究工作中已经分别对包括尿素酶B（UreB）、热休克蛋白A（HspA）、鞭毛粘附素（HpaA）等在内的多个Hp的亚单位蛋白进行了研究，取得了相应的研究结果。本研究拟采用UreB、HspA两个亚单位部分片段构建融合基因，构建双价基因疫苗，进行Hp多亚单位组分基因疫苗的研究。为进一步探索基因疫苗存在的保护性机制以及构建Hp多肽疫苗打下基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  细菌及细胞

　　幽门螺杆菌ACTC11637、E.coli DH5α、pCDNA3.1（+）和COS7细胞均由本室保存。

　　1.2  试剂和仪器
 
　　Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、pMD18T载体购自大连Takara公司；胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自Omega公司；rUreB、rHspA重组蛋白、兔抗rUreB、rHspA血清本室制备；羊抗兔IgG酶标抗体购自晶美公司。

　　1.3  DNA双价疫苗的构建

　　采用Primer 5.0软件设计相关的引物，PCR从幽门螺杆菌基因组中分别扩增UreB和HspA基因片段，通过对融合后双亚单位基因核苷酸以及载体多克隆位点的检索与选择，设计相应重叠延伸PCR的引物，在重叠延伸生成的片段的上下游分别引入BglⅡ和XhoⅠ酶切位点，重叠延伸PCR将2个基因构建成为一个融合基因插入到T克隆载体上，经测序验证序列正确后，双酶切将融合基因片段插入真核表达载体pcDNA3.1（+）中。

　　1.4  真核细胞转染及体外表达

　　采用omga质粒大抽试剂盒抽提质粒，紫外分光光度计260/280双波长定量，脂质体法常规方法转染COS7细胞，24～48小时后收集培养上清，预处理后8%SDSPAGE蛋白电泳，电转移PVDF膜后以5%牛血清白蛋白封闭过夜，分别以兔抗UreB、HpaA抗体为一抗，羊抗兔IgG为二抗进行Western blot实验。

　　1.5  小鼠的免疫试验及特异性抗体的检测

　　20只小鼠随机分为2组，分别以空质粒和构建的真核表达载体质粒DNA与0.75%布比卡因4∶1体积比混合，小鼠左右胫前肌和股四头肌多点注射，每3周免疫1次，共3次，末次免疫后3周分别收集小鼠血清，抗体稀释液1∶200倍稀释待检血清，100 μl/孔，分别加入已包被Hp UreB、HspA蛋白的ELISA板，37℃ 60分钟，洗涤液洗涤4次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶20 000)，100 μl/孔，37℃ 30分钟，洗涤4次，加入OPD底物显色液，室温避光反应30分钟，50 μl终止液终止反应，以PBS孔作空白对照，492 nm测定各孔OD值。

　　1.6  攻毒保护实验

　　20只小鼠，免疫方法同前，分为2组，每组10只小鼠，于末次免疫后10天免疫组与对照组用Hp ATCC11637株菌液进行灌喂。所有小鼠提前24小时断食、断水，每只灌喂约108 CFU菌液，上、下午各1次，间隔6小时，末次后2小时进食水。攻毒后4周小鼠脱颈处死。取出鼠胃，沿胃大弯剖开，用生理盐水轻轻冲掉胃内残留物，将胃粘膜组织涂布Hp专用培养基，三线法划线接种，微需氧培养72小时后检测。

　　2  结果

　　2.1  DNA双亚单位载体的构建和鉴定

　　PCR自Hp基因组中分别扩增出UreB和HspA片段，见图1A中4、5条带；采用重叠延伸PCR的方法以第1次扩增的UreB和HspA片段基因为模板，2次扩增得到HspAUreB融合基因hu片段，见图1A中2、3条带。

　　2.2  真核表达载体的构建和鉴定

　　由序列检索得知，目的融合基因与真核表达载体上各存在一个HindⅢ酶切位点，构建成功的表达载体pcDNA3.1(+)hu的重组质粒经HindⅢ和XhoⅠ双酶切呈现三条带，小片段分别约为300、800 bp，大片段与空载体单酶切相同大小约为5 000 bp，与预计相符，证明构建成功，见图1B。

　　2.3  融合基因在细胞中的表达

　　兔抗Hp血清Western blot结果显示在20 000附近出现一明显褐色沉淀，未转染细胞相应部位没有条带产生，见图2。

　　2.4  小鼠血清特异性IgG检测结果

　　末次免疫后1个月，分别以UreB、HspA蛋白通过ELISA的方法检测，pcDNA3.1hu免疫组血清中的特异性IgG比空质粒免疫组增高，差异显著，见表1、图3。表1  免疫后BALB/c小鼠血清抗Hp特异抗体反应情况（略）

　　2.5  攻毒保护试验的结果

　　免疫后10天动物保护试验各组结果见表2，可以看到pcDNA3.1(+)hh质粒免疫组与空质粒组保护率相比差异显著(P<0.001)。表2  各实验组小鼠免疫后Hp攻毒情况（略）

　　3  讨论

    幽门螺杆菌是一种全世界范围的人类感染病原菌，感染率占世界人口的一半以上。自1982年Warren和Marshall发现Hp以来，人们经研究确认其与B型(胃窦)胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌等多种疾病相关，1998年世界卫生组织将其列为一类致癌因子。对Hp的免疫发病机制和免疫接种诱发的保护性机制的逐步了解，使人们认清通过疫苗刺激机体产生不同于自然感染的保护性免疫反应，可以预防和治疗Hp感染。近年来，国内外学者对其展开了一系列的研究，大多数研究都是针对单亚单位和蛋白质疫苗为主的疫苗研究。基因疫苗由质粒转染细胞产生的蛋白质，能按其天然构象进行折叠，从而有利于中和抗体的产生；而且质粒载体还包含了免疫刺激核苷酸序列［非甲基化胞苷酸鸟苷(Cytidinephosphateguanosine, CpG)］，可在动物中诱导强而持久的免疫应答［5］。在针对Hp疫苗的研究过程中，国外已经构建了表达热休克和过氧化氢酶的DNA疫苗，这些DNA疫苗在实验中能够激发机体的体液和细胞免疫，攻毒保护试验也证实了DNA疫苗在Hp研究中的作用。近在采用尿素酶B亚单位构建的DNA疫苗免疫研究发现，DNA疫苗除了能够够激发机体的相应的免疫应答外，还可以激发机体的初始免疫应答，能够更有利的预防和清除感染。

    Ruggiero等认为在细菌感染过程中，由于宿主和致病菌之间有着复杂的作用机制，单一抗原组分构建的疫苗难以产生完全有效的保护作用，混合多抗原成分的疫苗可以激发机体更强的免疫应答，将会是更完美的疫苗形式［6，7］。在Hp单个保护性抗原疫苗研究基础上，构建的多亚单位疫苗具有Hp多个抗原组分，能够激发机体产生比单一亚单位成分更强的免疫反应，抗原成分相对全菌疫苗简单，减少机体变态反应的发生。国内朱森林等分别构建了表达UreB/HpaA、UreB/HspA双价抗原的沙门氏减毒疫苗，动物保护实验中证实比单一成分亚单位疫苗效果更好［810］。李明峰等［4］分别进行了HspA/UreB、OMP/HspA融合蛋白多价疫苗构建的研究，但是并没有动物实验的结果。Malfertheiner等在采用Vac、CagA、NAP的3个亚单位体外混合构建的联合疫苗研究中也取得了理想的结果，已经进入Ⅰ期临床试验研究。

    以融合基因方式获得多组分疫苗与其他方式相比具有许多优势。我们在前期Hp疫苗的研究中，以基因融合的方式构建分子内佐剂融合疫苗，获得很好的效果，也为融合基因方式构建多亚单位疫苗研究打下了基础。融合抗原在口服以及DNA的形式免疫小鼠都使小鼠产生了相应的免疫应答保护，得到了足够的保护力。揭示在将来随着Hp免疫保护机制逐步清除，更好的抗原选择和组合，更好的免疫途径，诱导一种正确的免疫反应。Hp的感染是能够被阻止，也是能够可以清除的。

【参考文献】
  　　1 朱森林，陈旻湖，陈 洁 et al. 优化构建UreB/HpaA双价幽门螺杆菌减毒活菌疫苗的免疫保护作用 ［J］.中华消化杂志,2003;23(10):583586.

　　2 李 勣, 刘纯杰, 李淑琴 et al. 幽门螺杆菌UreB及UreBHspA融合基因在减毒鼠伤寒沙门菌中的表达及小鼠的免疫应答 ［J］. 中华微生物学和免疫学杂志,2003;23(7):513516.

　　3 廖文俊, 陈旻湖, 朱森林 et al. UreA/KatA双价减毒沙门菌疫苗株抗幽门螺杆菌的免疫保护作用 ［J］. 中华微生物学和免疫学杂志,2001;21(6):642646.

　　4 李明峰, 何志勇, 凌 贞 et al. 幽门螺杆菌HspA和UreB双价侯选疫苗株的构建 ［J］. 中华微生物学和免疫学杂志,2000;20(3):232235.

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　　6 Mattsson A, QuidingJarbrink M, Lonroth H et al. Antibodysecreting cells in the stomachs of symptomatic and asymptomatic Helicobacter pylori infected subjects ［J］. Infect Immun, 1998; 66:27052712.

　　7 D’Elios M M, Manghetti M, Almerigogna F et al. Different cytokine profile and antigenspecificity repertoire in Helicobacter pylorispecific T cell clones from the antrum of chronic gastritis patients with or without peptic ulcer ［J］. Eur J Immunol, 1997; 27:17511755.

　　8 Bamford K B, Fan X, Crowe S E et al. Lymphocytes in the human gastric mucosa during Helicobacter pylori have a T helper cell 1 phenotype ［J］. Gastroenterology, 1998; 114:482492.

　　9 Goto T, Nishizone A, Fujika T et al. Local secretory immunoglobulin A and postimmunization gastritis correlate with protection agaist Helicobacter pylori infection after oral vaccination of mice ［J］. Infec Immun, 1999; 67(11):25312539.

　　10 Blanchard T G，Czinn S J，Maurer R et al. Ureasespecific monoclonal antibodies prevent Helicobacter felis infection in mice ［J］. Infect Immun, 1995; 63:13941399.

作者：袁小澎 邹全明 洪愉 柏杨 吴超 张卫军

作者单位：第三军医大学检验系临床微生物及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心，重庆 400038