B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因在293T细胞表达

【摘要】  本研究目的是构建含有人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因的慢病毒载体，观察其在293T细胞中的表达情况。 用限制性内切酶法获得B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因(BDDhFⅧcDNA)片段,将其克隆至慢病毒载体pXZ208，构建了慢病毒表达载体pXZ208BDDhFⅧ；用限制性内切酶法鉴定载体的连接方向，用磷酸钙共沉淀法将重组质粒pXZ208BDDhFⅧ分别与包装质粒ΔNRF、包膜蛋白质粒VSVG共转染293T包装细胞，包装后感染293T细胞，并以pXZ171作为对照。在感染后用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测BDDhFⅧ基因的转录，一期法检测细胞培养上清FⅧ的活性，流式细胞仪(FCM)检测载体的感染效率，PCR检测BDDhFⅧ基因的整合。结果表明： 成功构建了慢病毒表达载体pXZ208BDDhFⅧ，其基因转导染效率达到了59.57%。RTPCR法能够检测到BDDhFⅧ转录的mRNA。感染后24、48、72小时检测到细胞上清中FⅧ活性(FⅧ∶C)分别为12%、43%、87%。PCR法扩增出了534 bp的特异性片段。结论： 成功构建的慢病毒表达载体pXZ208BDDhFⅧ，在体外可以有效感染293T细胞并表达有活性的FⅧ，提示基因治疗可应用于血友病A。

【关键词】  慢病毒

    ex[x]pression of B DomainDeleted Human Coagulant Factor Ⅷ Gene  in 293T Cells Mediated by Lentiviral Vector In Vitro

    CHENG Hai, XU KaiLin, SUN HaiYing, DU Bing, ZENG LingYu, LU QunXian, HE XuPeng, PAN XiuYing

    Department of Hematology, The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221000, China

    Abstract    This study was aimed to construct a lentiviral vector carrying human coagulant factor Ⅷ (FⅧ)  and to investigate  its ex[x]pression in 293T cells.    Bdomaindeleted factor Ⅷ gene fragment (BDDhFⅧcDNA) was obtained by enzyme digestion and cloned into lentiviral vector pXZ208 to establish the ex[x]pression vector pXZ208BDDhFⅧ. Recombinant viral particles were prepared by cotransfection with packaging plasmid ΔNRF and envelope plasmid VSVG using calcium phosphate precipitation method. 293T cells were transfected by viral supernatant. Coagulant activity of FⅧ， BDDhFⅧmRNA and genome integration were  assayed by onestep method, RTPCR and PCR after transfection. The results showed that  293T cells could be transfected by recombinant virus. The transfection rate of 293T was 59.57%. After transfection, the cells expressed     FⅧ efficiently. Detection confirmed that  the activity of FⅧ was 12%,43% and 87% respectively  at 24,48 and 72 hours after infection.  BDDhFⅧ transc[x]ription was detected by RTPCR from the infected cells. The gene integration in the targeted cells was also observed.  It is concluded that the successfuly constructed lentiviral vector is able to generate high level ex[x]pression of human FⅧ in 293T cells, which  may provide a potential application of  gene therapy to haemophilia A.

    Key  words    lentiviral vector； coagulant factor Ⅷ； gene ex[x]pression

    J Exp Hematol 2007; 15(5):1074-1078

    血友病A是一种X连锁隐性遗传性出血性疾病，目前对该病的治疗主要以蛋白替代疗法为主，但是有感染人免疫缺陷病毒(HIV)和病毒性肝炎等传染病的危险［1-3］。随着分子生物学技术的发展，基因治疗成为血友病A的一种理想模式。目前以病毒载体为基础的基因治疗的研究已经广泛开展，其中来源于人免疫缺陷病毒I(HIVI)的慢病毒载体具有免疫原性小、可以稳定整合到宿主的染色体，有利于目的基因长期表达。为了探讨慢病毒载体治疗血友病A的可行性，我们构建了含有人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因的重组慢病毒载体，并观察其在人胚肾细胞(293T)细胞中的表达。

    材料和方法

    材料

    菌株E Coli DH5ɑ、慢病毒载体pXZ208、pXZ117(含有编码增强型绿色荧光蛋白的基因片段，EGFPcDNA)为本室保存。pDLZ6(含有B区缺失的人凝血因子Ⅷ片段，BDDhFⅧcDNA)由美国北卡罗来那大学的晁恒军博士惠赠。 293T细胞由本实验室冻存。DMEM购自Gibco公司。胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公中国实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(5)B区缺失的人凝血因子Ⅷ在293T细胞中的表达司。各种工具酶、1 kb DNA Ladder、质粒小量提取试剂盒（WizardTMPlus SV Minipreps DNA Purification System）、质粒中量提取试剂盒（PureYieldTM Plasmid Midipre System）、目的基因纯化试剂盒（WizardTM PCR DNA Purification System）、线性化载体回收试剂盒（WizardTM DNA CleanUp System）、反转录试剂盒（Access RTPCR System）、 PCR扩增试剂盒（PCR Master Mix）、RNA提取试剂盒（RNAgents  Total RNA Isolation System）均购自Promega 公司。Factor Deficient Plasmas 购自美国的Pacific Hemostasis 公司。

    慢病毒表达载体的构建和鉴定

    采用限制性内切酶Xhol I 单酶切载体pDLZ6，得到4 435 bp的目的基因BDDhFⅧcDNA，低熔点凝胶回收后插入到慢病毒载体pXZ208的Xhol I位点，Xhol I、Kpn I 单酶切鉴定重组子。将正确连接的重组子命名为pXZ208BDDhFⅧ。

    细胞培养

    DMEM加10% FBS常规培养293T细胞,每2-3天 换液1次,胰酶消化传代,倒置显微镜下观察细胞的生长状况。

    重组慢病毒的包装

    采用磷酸钙共沉淀法［4］将重组质粒pXZ208BDDhFⅧ(15 μg)分别与包装质粒ΔNRF(10 μg)、包膜蛋白质粒VSVG(5 μg)共转染293T包装细胞，用无血清的培养基在37℃、5% CO2条件下培养3小时后，加入FBS,使其终浓度达到10%，12小时后更换全部培养液，37℃、5% CO2条件下继续培养。72小时后收集病毒上清，过滤后-80℃保存。同时以携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒载体pXZ171作为对照，观察GFP表达情况。

    病毒滴度的测定

    将293T细胞按照2×105/孔接种于6孔板上，吸附6小时后，将所收集的含pXZ171的病毒上清分别按对数级稀释，将1 ml稀释后的病毒上清分别加入到相应的孔中，过夜培养后，更换培养基，48小时后，于荧光显微镜下计数荧光阳性细胞个数，并计算病毒滴度，用流式细胞仪（FACS）检测GFP阳性细胞百分率。病毒滴度的计算公式为：

    病毒滴度（U/ml）=GFP阳性细胞数×

    相应的稀释倍数 ［5］

    感染靶细胞

    将细胞293T以 1×106 的密度接种于培养瓶中，在37℃、5% CO2条件下培养24小时后换以新鲜培养液，加入5 ml的重组慢病毒上清液，同时加入polybrene使其终浓度为8 μg/ml，轻轻混匀后，继续培养48小时后，荧光显微镜下观察GFP表达情况，并用FACS检测病毒的感染效率。

    细胞培养上清中凝血因子Ⅷ活性(FⅧ∶C)的检测

    取感染后24、48、72小时的细胞培养上清液，一期法检测FⅧ活性。

    细胞中BDDhFⅧ mRNA的转录

    感染后48小时收集培养细胞(约5 ×106 个) ，RNAgents Total RNA Isolation System试剂盒提取细胞的总RNA，按照Access RTPCR System试剂盒的操作说明，用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测细胞中BDDhFⅧmRNA的转录。设计1对BDDhFⅧcDNA的特异性引物，上游引物序列为：5′TTCTCCCCAATCCAGCTGG3′，下游引物序列为：5′GAGTTATTTCCCGTTGATGG 3′，扩增片段为534 bp。逆转录条件为42℃ 10分钟，95℃ 5分钟。PCR扩增条件为95℃ 2分钟 ，95℃ 1分钟, 55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，72℃ 4分钟，30个循环后电泳观察结果。

    BDDhFⅧ cDNA 基因的整合

    将感染后的细胞传代培养，传代3次后收集细胞，按照试剂盒的操作说明书提取细胞的基因组，PCR法检测基因的整合。上游引物序列为5′TTCTCCCCAATCCAGCTGG3′，下游引物序列为5′GAGTTATTTCCCGTTGATGG 3′，扩增片段为534 bp。PCR扩增条件为95℃  2分钟 ，95℃ 1分钟， 55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，72℃ 4分钟，30个循环后，电泳观察结果。

    结    果

    重组慢病毒表达载体pXZ208BDDhFⅧ的鉴定

    构建的重组质粒全长13 018 bp。根据酶切图谱，采用Xhol I、Kpn I 分别单酶切重组质粒，当连接正确时，用 Xhol I单酶切重组质粒后得到4 435 bp和8 583 bp两个片段；用Kpn I单酶切重组质粒后得到3 341 bp和9 677 bp两条片段(图 1)。

    慢病毒的包装

    采用磷酸钙共沉淀法将pXZ208BDDhFⅧ分别与  ΔNRF、VSVG共转染293T包装细胞，并以pXZ171作为对照。24小时后即可观察到GFP的表达，48小时后GFP荧光强度明显增强(图2)。72小时收集病毒上清，经0.45  μm滤膜过滤后保存于-80℃。

    Figure 2.  GFP ex[x]pression in 293T cells after transfection.

    重组慢病毒的滴度

    将293T细胞按照2×105/孔接种于6孔板上，培养6小时后加入病毒上清，并加入polybrene使其终浓度8     μg/ml。12小时后可以看到荧光，48小时后荧光明显增强。此时在荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数，并计算病毒滴度。病毒滴度在未经超速离心的情况下达到了(2.18±0.64)×106 U/ml。

    靶细胞培养上清中FⅧ活性的检测

    感染后24小时即可检测到FⅧ表达，活性为12%，48小时活性达到了43%，72小时时为87%。

    感染效率的测定

    慢病毒感染293T细胞后48小时荧光显微镜下即可观察到GFP较强表达 (图 3)，感染效率达到了59.57%(图 4)。

    Figure 3.  GFP ex[x]pression in 293T cells after transfected by recombinant lentiviral vector at 48 hours.

    Figure 4.  Infection rate of 293T cells detected by FCM. A: 293T cells before infection.  B:  293T cells after infection.

    BDDhFⅧ cDNA的转录

    感染后的293T细胞都扩增出了534 bp的特异性条带（图5中第1泳道），而阴性对照组无此条带（图5中第2泳道）。

     BDDhFⅧcDNA 基因的整合

    将感染后的细胞传代培养，传代3次后收集细胞，提取基因组后PCR法扩增出534 bp的特异性条带（图6中第1泳道），阴性对照组无此条带（图6中第2泳道）。

    讨    论

    近年来，病毒载体在基因治疗中的安全性受到越来越多的关注，其存在的主要问题有以下几个方面：首先，病毒基因插入到宿主的基因组中，有可能导致基因组中的前癌基因被激活；其次，在包装细胞和靶细胞中产生具有自我复制能力的病毒；另外导入的外源基因的表达有可能引发炎症或者免疫反应，而且，当重复实验时，病毒也许会进入到外界而感染他人［6-8］。本实验所采用的是第3代自我失活的慢病毒载体，这种载体删除了病毒基因组的3′长末端重复序列(LTR)中的U3区,换以人巨细胞病毒及早启动子(CMV)代替，使重组病毒的LTR端丧失了转录启动的功能，减少了自我复制能力(RCL)的慢病毒的产生［9，10］。多聚嘌呤通道(cPPT)的插入增加了重组病毒对靶细胞的转导效率［11，12］。慢病毒的env基因被编码人口炎疱状病毒糖蛋白(VSVG)的env所代替，增加了重组病毒的稳定性，从细胞培养上清中就可直接获得病毒颗粒，使其通过超速离心达到高滴度［13］。

    实验中，我们采用磷酸钙沉淀法将重组质粒pXZ208BDDhFⅧ(15  μg)分别与包装质粒ΔNRF(10 μg)、包膜蛋白质粒VSVG(5 μg)共转染293T包装细胞，并以携带GFP的pXZ171作为对照，实现了转染过程的可视化，在未经超速离心的情况下，重组慢病毒的滴度达到了106数量级，Xu［14］等报道,经过超速离心后，病毒滴度可达到109 U/ml，能够满足临床治疗的需要。

    在基因治疗中，启动子的选择对外源基因的表达至关重要。实验中，我们选择了具有较高启动活性的CMV驱动FⅧ的表达。RTPCR、FⅧ∶C检测结果表明，重组慢病毒可以很好的介导FⅧ在293T包装细胞中的基因转移和表达。这大概是由于人源细胞系更有利于BDDhFⅧcDNA的表达调控，此外也可能和293T细胞生长较旺盛、更易于感染有关系。

    理想的基因治疗是载体能够整合到靶细胞的基因组中，长期表达治疗量的FⅧ。我们将感染后的靶细胞进行传代培养，结果用PCR的方法在子代细胞中检测到了的BDDhFⅧ cDNA特异性片段，证实目的基因已经成功的整合到靶细胞的基因组中，为目的基因的长期表达提供了基础。

    以上研究表明，我们构建的重组慢病毒载体pXZ208BDDhFⅧ在包装后能够有效的感染包装细胞和靶细胞，并且能够高效的表达功能性的FⅧ，为血友病A的基因治疗的体内研究奠定了基础。

【参考文献】
  1Ponder KP. Novel therapies for hemophilia A. Blood，2003；12: 3857-3858

2High KA. Gene transfer as an approach to treating hemophilia. Circ Res, 2001；88:137-144

3Ragni MV. Safe passage: a plea for safety in hemophilia gene therapy. Mol Ther, 2002；6:436-440

4Chen CA,Okayama H. Calcium phosphatemediated gene transfer: a high efficient transfection systerm for stably transforming cells with plasmid DNA. Biotechniques,1988; 6:632-638

5李振宇，徐开林，潘秀英等. HIV1慢病毒载体的构建及结构改造. 中华血液学杂志，2004; 25：571-572

6Yang Y, Jooss KU, Su Q, et al. Immune responses to viral antigens versus transgene product in the elimination of recombinant adenovirusinfected hepatocytes in vivo. Gene Ther, 1996；3:137-144

7Lozier JN, Metzger ME, Donahue RE, et al. Adenovirusmediated ex[x]pression of human coagulation factor IX in the rhesus macaque is associated with doselimiting toxicity. Blood，1999; 94:3968-3975

8Sadelain M. Insertional oncogenesis in gene therapy: how much of a risk? Gene Ther,2004；11: 569-573

9Zufferey R, Dull T, Mandel RJ, et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J Virol, 1998； 72:9873-9880

10Miyoshi H, Blomer U,Takahashi M, et al. Development of a self-inactivating lentivirus vector. J Virol, 1998；72:8150-8157

11Follenzi A, Ailles LE, Bakovic S, et al. Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences. Nat Genet, 2000；25:217-222

12Zennou V, Petit C, Guetard D, et la. HIV-1 genome nuclear import is mediated by a central DNA flap. Cell, 2000；101:173-185

13Naldini L, Blomer U, Gallay P, et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science,1996；272（5259）:263-267

14Xu K, Ma H, McCown TJ, et al. Generation of a stable cell line producing hightiter selfinactivating lentiviral vectors. Mol Ther, 2001；1:97-104

 

作者：程海，徐开林， 孙海英， 杜冰， 曾令宇， 鹿群先， 何徐彭， 潘秀英

作者单位：徐州医学院附属医院血液科，徐州 221002