老年人载脂蛋白E基因多态性、骨密度和骨量丢失

【摘要】  探讨老年人载脂蛋白E（ApoE）基因多态性与髋骨密度（BMD）、骨丢失的关系。方法:随机选取沈阳市60岁以上汉族健康老年人100名，用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCRRELP）方法检测ApoE基因型，用DPX-L双能X线吸收仪（Lunar,USA）分别在2000年和2005年两次测量研究对象髋部骨密度。结果：该人群ApoE基因型频率分布为 E2/3:17%, E3/3:66%,E3/4:15%, E4/4:1%，没有E2/2和E4/4型。等位基因频率分部为ε2：8%，ε3：84%，ε4：8%。无论男女携带ApoE4基因组和不携带ApoE4基因组间年龄、身高和体重均无差异。在2000年，携带ApoE4基因组和不携带ApoE4基因组两组股骨颈、大转子和 Ward区的骨密度经身高、体重和年龄校正后，男女均没有显著性差异；相同分析各部位年骨丢失率也没有显著性差异。结论：该人群ApoE基因型与髋部骨密度无明显相关性。

【关键词】  载脂蛋白E；基因多态性；骨密度；骨丢失

　　Apolipoprotein E Ｅene Ｐolymorphism, BMD, and Ｂone Ｌoss in Ｏlder Ａdults

　　ZHOU Bo, WANG Xiaohong, WANG Songtao, GUO Lianying1,XU Chao, ZHANG Zhou, KAN  Zhiying

　　(1.The Department of Nutrition and Food Hygiene, Shenyang Medical College, Shenyang　110034, China;2.Northeastern University)

　　Abstractob[x]jective:To study the association between the ApoE gene polymorphism and bone mineral density (BMD), bone loss in older adults.Methods:One hundred healthy Han volunteers over 60 years old in Shenyang were selected.ApoE gene was measured by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRELP).BMD at hip was measured using dual-energy X-ray (DPXL) absorption apparatus (Lunar,USA) in 2000 and 2005, respectively.Results：The ApoE gene phenotype in the population was E2/3: 16%, E3/3: 66%, E4/3:15%, E4/4:1%, while E2/2 and E4/2 was not found. The ApoE all lelomorph frequencies were 8% forε2，84% forε3，8% forε4. There were no difference in age, height and weight with the presence ApoE4 and absence ApoE4 in women and men. In 2000， after adjustment for height, weight, and age, there was no significant difference of the BMD in the femoral neck, trverosity and Ward areas between presence Apo E 4 and absence ApoE4 women and men. Annualized bone loss rate at hip did not differ by ApoE genotype for women and men. Conclusion:In our data, there is no significant association between Apo E genotype and BMD, bone loss of hip.

　　Key wordsApolipoprotein E gene; polymorphism; bone mineral density; bone loss

    骨质疏松症是与多种基因相关的疾病，其侯选基因的研究对于评估骨质疏松性骨折的危险性、基因诊断和治疗具有重要作用。近年来，国内外学者越来越重视载脂蛋白E（ApoE）基因多态性与骨质疏松的关系。有研究表明ApoE4型基因携带者骨量丢失速度快，易导致原发性骨质疏松症及其骨折[1-3]。而另一些研究没有观察到ApoE基因多态性与骨密度及骨丢失有关[4-7]。本文探讨了沈阳市老年人的ApoE基因多态性与髋部骨密度及骨量丢失的关系。

　　１  对象与方法

　　1.1  对象

　　2000年3月在沈阳市某社区内随机选出无血缘关系60岁以上的汉族健康老年人作为研究对象，排除患有糖尿病、甲状腺疾病、肾脏疾病等影响骨代谢的疾病,并未服用维生素D和钙补充剂，严重高脂血症者也被排除。于2005年3月对上述研究对象进行跟踪研究，将资料完整者纳入本文，共100名，其中男 46名，年龄（66.8±4.7）岁，女54名，年龄（64.6±3.8）岁。

　　1.2  方法

　　1.2.1  ApoE基因型测定

　　取静脉血5ml经EDTA抗凝，DNA提取试剂盒（QIAamp DNA Mini Kit ）提取DNA。PCR引物按参考文献设计[8]。上下游引物序列分别为：5’TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA3’；5’ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACACTGCCA3’。PCR反应体系为50μl，包括基因组DNA3μl，10×扩增缓冲液；dNTPs 各200 μmol/L；引物各25pmol。二甲基亚枫5μl，MgCl22.5mmol/L, Taq DNA 聚合酶2 U （Promega ）。置热循环仪（Biometra,T3）中按下列程序循环30次，即95℃变性30s ,60℃退火30s ,72℃延伸1min 30s，后72℃再延伸10min。限制性酶切反应在40μl体系中进行，包括PCR反应产物10μl，Cfo I限制性内切酶20U（Promega），37℃，4 h。采用非变性聚丙烯酰胺电泳（浓度为12%，交联度29：1），在常温，离子强度为1×TBE条件下，70V恒压电泳1.5h，分离Cfo I产物。0.5ml/L 浓度的EB中染色40min，在紫外灯下观察、照像，分型。基因分析在已知标准物的对照下反复进行多次，以排除错误出现。

　　1.2.2  髋部骨密度测定

　　用DPXL双能X线吸收仪（Lunar,USA）在2000年3月和2005年3月分别两次测定研究对象左测股骨颈、Ward三角和大转子区的骨密度（g/cm2）。体模反复测定的变异系数为0.45%。

　　1.3  统计学分析

　　用Data Desk 6.1 软件(Data Desc[x]ription Inc, Ithaca,NY)进行数据处理。基因频率采用基因计数法计算，基因频率比较采用似然比χ2检验。每位研究对象年骨丢失率=（第2次骨密度值－第1次骨密度值）/第1次骨密度值／5×。为校正部分偏态分布数据，将数据（除年龄外）均变成自然对数后再进行分析。各组内的骨密度比较采用配对t检验。基因型各组间骨密度均值和年骨丢失率的比较用协方差分析，因为已知身高、体重和年龄是影响骨密度的因素，在分析时均以这些因素校正。

　　2  结果

　　2.1  ApoE基因型及等位基因频率分布

　　该人群ApoE基因型分布为E2/3：17 %,E3/3：66%,E4/3：15%，E4/4：1%，没有E2/2和E4/2型。等位基因频率分别为ε2：8%, ε3：84%,ε4：8%。男女间等位基因频率经χ2检验差异无统计学意义（χ2=1.81,P>0.05）。

　　2.2  ApoE基因型对髋部骨密度的影响

　　携带ApoE4基因组(E4/3和E4/4)和不携带ApoE4基因组(E3/2 和E3/3)人群年龄、体重、身高和人体重指数（BMI）没有显著性差异。比较男性、女性携带ApoE4基因组和不携带ApoE4基因组间股骨颈、大转子和Ward 区的第1次骨密度，经年龄、身高和体重校正后，差异没有显著性。

　　2.3  ApoE基因型对骨丢失的影响

　　男女各组髋部骨密度第二次均明显低于次。经年龄、身高和体重校正，无论男女携带ApoE4基因组和不携带ApoE4基因组间股骨颈、大转子和Ward 区的年骨丢失率差异均无显著性统计学意义。表１Apo E基因型与髋部骨密度、骨丢失情况（略）注：1)与本组次比较，P＜0.01

　　3  讨论

    本研究所分析人群的ApoE基因频率与国内研究报道的结果相似[7，9]，具有群体代表性。研究表明ApoE4基因型与一些疾病有关，本研究对象已排除可能与Apo E4基因型有关的疾病，如患有糖尿病、甲状腺疾病、肾脏疾病等影响骨代谢的疾病,患有严重心血管疾病和高脂血症者也被排除。

    一些研究认为AopE基因型通过影响血浆维生素K和骨钙素水平调节骨代谢，ApoE2型和ApoE3型者血浆维生素K水平高于ApoE4型者，因此骨钙素羧化程度较高，有利于骨形成[10]。Masataka等[10]报道ApoE4等位基因与绝经后日本妇女低骨密度密切相关，携带ApoE4等位基因者骨密度低。Villarreal等报道[1]携带ApoE型者骨丢失速率快，陶军和胡建华[2，3]均报道中国绝经后妇女原发性骨质疏松患症者ApoE4型等位基因频率明显高于正常对照者。但也有报道没有观察到ApoE基因型与骨密度的关系。Schoofs MW 等[4]对5 857名白人进行2到7年的跟踪没有观察到ApoE4 基因型对髋部骨密度和骨丢失的影响。Wong SY 等[7] 调查了香港人也没有发现ApoE基因型与髋部骨密度有关。本文结果显示该人群ApoE基因型与髋部骨密度、骨丢失无明显相关性。由于ApoE基因型分布具有种族和地区差异，中国人Apo E4型携带者少，在本文中，研究对象人数100名，ApoE4型携带者仅16名可能影响结果。因此，关于ApoE基因多态性对骨密度和骨丢失的影响还需大样本长期的研究。

【参考文献】
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　　［3］胡建华，黄公怡，王晓霞,等. 载脂蛋白E基因多态现象与原发性骨质疏松症相关性的初步研究\[J\]. 中华骨科杂志，1999,19（10）：597-599．

　　［４］Schoofs MW, Ｖan der Klife M, Hofman A, et al. ApoE gene polymorphisms, BMD, and fracture risk in elderly men and women: the Rotterdam study \[J\]. J Bone Miner Res，2004, 19(9):1490-1496.

　　［5］Otsuki T, Sakaguchi H, Hatta E, et al. Effects of genetic and nutritional factors on bone mineral density in young adults \[J\]. Int J Mol Med,2004,14(4):669-676．

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　　［7］Wong SY, Lau EM, Li M, et al. The prevalence of Apo E4 genotype and its relationship to bone mineral density in Hong Kong Chinese \[J\]. J Bone Miner me[x]tab, 2005, 23 (3)261-265.

　　［8］Philip RW, William HP, Gillian B. Apolipoprotein E genotyping by onestage PCR \[J\]. The Lancet，1991;337:1158-1159．

　　［9］刘毅, 朱建华，潘闵，等.不同人群载脂蛋白E基因频率分布特征\[J\]. 中国现代医学杂志，2002，12：15-16．

　　［10］Masataka S, Youmiko S, Choju A, et al. Association of bone mineral density with apolipoprotein E phenotype\[J\]. J Bone Miner Res，1997,12:1438-1445

作者：周波,王晓红,王松涛,郭连营,徐超,张卓，阚志英

作者单位：沈阳医学院营养与食品卫生学教研室，辽宁沈阳110034