光谱核型分析技术在白血病中的应用

作者：郭搏,达万明,韩晓萍　　作者单位：中国人民解放军总医院血液科，北京 100853

　　【摘要】光谱核型分析技术是近几年建立的一种细胞遗传学检测方法，它可以在没有任何预知的情况下同时对人的24条染色体进行核型分析，可以识别常规显带和单纯应用荧光原位杂交难以精确辨认的一些畸变，具有高度的精确性、敏感性、直观性。本文综述了光谱核型技术的原理及其在白血病中的应用。

　　【关键词】 光谱核型分析

　　Abstract Spectral karyotyping (SKY) is a novel cytogenetic technique，has been developed to unambiguously display and identify all 24 human chromosomes at one time without a priori knowledge of any abnormalities involved. SKY discerns the aberrations that can not be detected very well by conventional banding technique and fluorescent in situ hybridization (FISH). So SKY is hyper-accurate，hypersensitive，and hyper-intuitional. In this paper the basic principle of SKY technique and its application in leukemia cytogenetics were reviewed.

　　Key words spectral karyotyping; chromosome; karyotype; leukemia

　　自引入染色体显带技术以来，在白血病及其它恶性血液病中发现了大量的重复性畸变，从而使染色体核型检测不仅成为白血病确诊和分型的重要依据，而且作为独立的预后因素之一，对诱导缓解和复发的判断提供了有价值的参考。1997年，WHO已明确将一些染色体异常列为急性白血病的特殊亚型。随着细胞遗传学技术的不断发展，人类对染色体核型的检测水平日益提高。在荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization，FISH)基础上，光谱核型分析技术(spectral karyotyping，SKY)、多色FISH(M-FISH)、彩色显带FISH(Rx-FISH)等技术将染色体分析带入彩色世界。1996年，Schrock等[1]报道了SKY技术。这一技术克服了传统FISH只能检测已知位点的异常的缺点，可以在没有任何预知的情况下将人类及小鼠的全部染色体以不同颜色显示出来，因而它可用于染色体的全面筛查，将白血病的细胞遗传学研究引向深入。

　　SKY技术的基本原理

　　SKY技术联合应用了光谱干涉仪、频谱遥感连接电荷耦合器件(charge-coupled-device，CCD)和傅立叶变换(fourier transformation)，在可见光和近红外范围去测量所有点的散射光谱，使得多光谱重叠探针得以应用，其成像及分析过程分为三部分。

　　杂交反应

　　SKY技术是将人类的24条染色体的涂染探针用5种不同的荧光素或其组合进行不同标记，然后将探针与中期分裂相进行原位杂交，其中SKY应用的涂染探针是流式细胞分选技术分拣出染色体，再经退化低聚寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)扩增获得的。

　　图像获取

　　杂交后的标本通过荧光显微镜获得荧光图像并进行光谱成像，其具体过程为由特制光源和滤镜激发所有荧光染料，通过光谱干涉仪，给特定的光谱分配红、绿、蓝3种显示色，又由CCD获取每一个像素的干涉图像，形成一个三维数据库，并得到每个像素的光程差与强度间的对应曲线。由于各条染色体所带有的单个荧光染料不同或组合不同，此曲线经傅立叶变换，再由计算机转换后会获得不同的区分色，这样再分配到每条染色体上，使得24条染色体可以不同颜色区分。

　　图像分析

　　经专门的SKY软件分析获得图像。

　　SKY与M-FISH的比较

　　1996年，Spicher等[2]报道了另一种以不同颜色描绘人类全部染色体的技术，成为M-FISH。尽管SKY和M-FISH都是在FISH的技术基础上发展的，但这两种技术在原理上是截然不同的。SKY技术是建立在离散光谱测量(在每个像素上以不同波长进行测量强度、频率)的基础之上的，其优点是可以立即并全面鉴定出染色体内的异常，如复杂的重组，易位等，并以不同颜色显示变化后的派生染色体。检测染色体内部重组时，SKY的精确性为500-1 500 kb[3]，当然这也取决于杂交的优劣及分裂相的伸展情况[1，4，5]。

　　SKY测量的是光谱，因而可以增强多色荧光团的识别力，用光谱核型全面分析获得信息。M-FISH的基本原理是滤镜成像，它是利用5种专门的荧光滤镜，通过CCD相机获得连续的图像，并连续的覆盖这些图像。滤镜对于小数目独立光谱的荧光时，分辨力较为可靠，但对于光谱重叠的染色体进行精确分析时，多滤镜的信号比较低，所以辨认的精确度也要降低。另外，其测量的是光强，易受干扰，特别在染色体的末端辨别力较差，而末端正是白血病染色体检测的重要部位[6]。因而在染色体检测上，总体讲，SKY要优于M-FISH。但SKY也不是完美无缺的技术，它的缺点是难以鉴定染色体内部改变，如一些小的缺失，重复及染色体内的倒位，不能将一些小的染色体片段的来源以可识别的颜色表示出来[7，8]，因此SKY技术也有待于进一步发展，并与其它细胞遗传学技术如传统显带，FISH、比较基因组杂交(CGH)等技术互补，以获得全面的核型[8-12]。

　　SKY在血液系统肿瘤中的应用

　　SKY技术问世以来，受到广泛的关注和研究。Veldman等[7]应用SKY研究恶性血液病，其中包括7例急性髓系白血病(AML)及骨髓增生异常综合症(MDS)患者。SKY分析证明了常规显带的结果，并发现了未被或未完全被显带鉴定出来的核型。由此证明，SKY可用于细胞遗传学分析，并具有较高的可靠性和敏感性。此后，SKY被应用于更大的样本中，研究水平不断提高，迄今已有600多例血液系统肿瘤应用SKY进行了核型分析。SKY逐渐成为常规显带技术的有力补充，其优势主要在以下几个方面。

　　SKY分析白血病细胞系

　　Mrozek等[13]应用SKY和FISH研究了红白血病细胞系KG-1和KG-1a的细胞遗传学，结果表明这两系细胞具有几个相同的核型异常，包括der(4)t(4;8)，del(7q)，der(8)t(8;12)，idic(8)(p11)，der(17)t(15;17)及der(20)t(12;20)，但这两系也有不同的染色体重排。相对于KG-1，KG-1a丢失了1或2个idic(8)(p11)拷贝，而在KG-1中，具有KG-1a不具备的der(8;22)(q24;q13)、i(11)(q10)和der(19)t(14;19)(q13;q13.4)。研究还发现有一部分KG-1细胞具有8号染色体长臂的六倍体，这与AML1-ETO基因具有相关性，为继续阐明这两系细胞的基因学区别，提供了线索。

　　CML是一种骨髓的克隆性疾病，具有由慢性期向急变期转变的倾向。NALM-1细胞系是从具有急变倾向的CML患者外周血中分离出来的，Pelz等[14]应用SKY及G显带及涂染FISH研究了NALM-1的细胞遗传学特征，报道CML核型为44，X，-X，der(7)t(7;9;15)(q10;?;q15)，der(9)t(9;9)(p24;q33-q34)t(9;22)(q34;q11)，der(15)t(7;9;15)(?;?;q15)，der(22)t(9;22)(q34;q11)。

　　在一项NK细胞系与NK细胞白血病患者的骨髓白血病细胞的染色体核型对比研究中，Chen等[15]将新的NK细胞系IMC-1培养55周后，将其与NK细胞白血病患者的骨髓白血病细胞，均应用SKY进行的染色体核型分析，发现两者均具有结构和数量的异常。所有在骨髓中具有的结构异常在IMC-1细胞系中均被发现，并且在细胞系中还有5个骨髓中没有的染色体重排，两者还均存在数量异常，骨髓细胞中存在+7，+8，而在IMC-1中存在有-9，-12，为研究NK细胞的白血病转化提供了依据。

　　SKY分析隐匿的染色体异常

　　Ohsaka等[16]报道了1例不典型的慢性粒细胞白血病(CML)，其G显带具有1个异常克隆，46，X，-Y，+der(?)t(?;1)(?;q21)及Ph染色体，但RT-PCR示bcr-abl基因阴性，经SKY及FISH分析核型为46，X，der(Y)t(Y;1)(q11.1 or.2;q12)，说明CML尚有Ph染色体阴性的。SKY联合常规显带及FISH对于疑难性核型的鉴定显示了重要作用。

　　25%-45%的成人初治AML患者及10%-30%的急性淋巴细胞白血病(ALL)患者经常规显带为正常核型。大部分传统显带示为正常核型的染色体标本在SKY分析后仍是正常的，但是仍有一部分G或R显带正常的核型被SKY鉴定出隐匿的异常[8，11，17-20]。Zhang等[11]应用SKY研究了28例常规显带正常核型的患者，发现有2例患者是常规显带没有鉴定出来的核型，其中1例为与MLL基因相关的隐匿的t(11;19)，另1例为7号染色体的单倍体克隆，这都与预后不良相关。Higenfeld等[17]的研究中也除了发现隐匿的t(11;19)外还发现了同样预示着预后不良的5q-。而在Kakazu等[8]的研究中同样发现了t(11;19)，说明这是一个容易被常规显带漏检的易位。

　　大约有75%-90%的儿童ALL患者具有克隆性染色体异常，而10%-25%的异常不能被常规G显带所发现。Lu等[20]应用SKY分析了29例初发的儿童前B细胞ALL的核型，鉴定出6例隐匿的t(12;21)(p14;q11)。在儿童ALL中，大部分12p的异常与t(12;21)(p13;q22)相关，并形成由位于12p13的TEL/ETV6基因与位于21q22的AML/CBFA2的融合基因。这种易位由于带型相似不容易被常规G显带鉴定出来，这6例患者后由TEL/AML1探针FISH重新检测，并确认了SKY的结论。另外SKY还鉴定出2例标记染色体，5例非重复性易位，并且鉴定出2例G显带没有检测出来的其它异常。这项研究表明SKY在鉴定复杂染色体异常方面具有更高的精确性。

　　SKY分析复杂核型

　　有一部分AL具有复杂核型，常规显带费时、费力，敏感性较低，尤其是鉴定缺失和一些不平衡易位时，一些相似的条带难以确定其来源。在这种情况下，SKY具有优越性，可以修正或补充常规显带的结论，获得更全面，更精确的核型。

　　Tchinda等[5]对35例包括AML、ALL、MDS在内的复杂核型的研究中，以SKY、G显带及FISH进行了研究。SKY共检测出149处异常，其中117处得到精确定位。有33例SKY扩展了G显带的结果，其中有7例患者由SKY发现了其它的异常，有5处为隐匿性的。另有8处G显带示为单倍体的，经SKY分析认为是标记染色体或派生染色体，3处缺失经SKY证实为易位。还有2例患者，由于G显带下具有相似的带型，显示部分核型为add(9)(p24)和add(6)(p11)，add(14)t(q32)，而经SKY分析证明这是不同的衍生染色体，核型为der(9)t(9;12)(p24;p11.2)及der(6;11)(q10;q10)，der(14)t(1;14)(?;q32)，后经FISH证实了SKY的结论。只有1例，SKY由于杂交不良没有获得结果。

　　随着血液病的发展，对染色体核型的精确度要求日益增高，尤其是在一些与预后密切相关的核型异常中，SKY分析能更准确的鉴定核型，祢补了常规显带的不足，甚至使患者的治疗及预后得以重新判断，因而对临床有重要的价值。

　　在Odero等[12]的报道中，有18例AML及MDS患者进行了SKY分析，有3例证明了G显带结果，其他15例，有一部分SKY补充了G显带的结果，另外还意外发现了一些隐匿的核型异常。其中有13例G显带具有-5或-7，或者具有3q-、5q或7q-的病例，SKY证实了其中6例的结果，但在其他7例患者中检测出了新的异常，为易位、环状染色体等其它异常。如有3例核型为-5的病例，SKY分析后认为为der(5)t(5;12)(q31;q13)、der(7)t(5;7)(q?13;p15)t(5;13)(q?33;q?22)和der(5)t(5;17)(q13;q2?3)。还有1例核型为del(5)(q15q33)，SKY分析其在5、6号染色体易位过程中丢失了部分5q，实际核型为der(5)t(5;6)(q15;p22)。5号及7号染色体的缺失及5q-，7q-往往预示者极为不良的预后，而调整分析后结果使这些患者的预后判定并不是那么差。

　　Mrozek等[21]研究了29例具有复杂核型的成人AML，经SKY分析揭示了全部不平衡易位中未知的染色体及大部分环状染色体和标记染色体的来源，重新分析了136种染色体异常，发现了3种隐匿的异常，SKY证实了10种并阐明了3种平衡易位，并发现了另外9个平衡易位，其中1个与RUNX1基因相关，并且发现8例患者具有+21q，其中有4例具有21q的大量扩增，FISH显示其中7例与RUNX1基因扩增无关，另一个获得频率较高的片断是11q，有7例患者，其中有3例具有MLL基因的扩增，有7例患者具有+22q。SKY提高了核型分析的精确性，并表明染色体的扩增在白血病细胞遗传学中有较重要的作用。

　　综上所述，光谱核型分析技术已成为非常有效的细胞遗传学研究工具，具有较高的精确性，敏感性和直观性，对于染色体异常的检测及新的白血病亚型的鉴定有重要意义。随着SKY的自我完善，及与其它细胞遗传学及分子生物学技术的结合，SKY的发展和推广将为白血病生物学研究带来更广阔的前景。

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