白细胞介素-17对人滑膜细胞基质金属蛋白酶-9基因表达的影响

作者：王加刚1,黄永辉1,焦志军2　　作者单位：江苏大学附属医院1.骨科; 2.检验科， 江苏 镇江

　　【摘要】目的：探讨白细胞介素-17(IL-17)对人滑膜细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因表达的调节作用及意义。方法：收集急性外伤性半月板损伤患者关节滑膜组织(8例)，采用组织块培养法进行原代滑膜细胞培养，加入不同浓度的重组人IL-17，培养12,24及36 h后收集细胞并抽提RNA，应用实时PCR检测滑膜细胞MMP-9 mRNA的表达。结果：组织块培养法可以获得高纯度的人滑膜细胞，且表达一定量的MMP-9。以10 ng/ml的IL-17作用滑膜细胞12 h后MMP-9 mRNA表达增加，24h到达高峰，36 h后明显下降(F=16.06，P<0.05)。以1,10,20 ng/ml的IL-17作用滑膜细胞24 h均上调滑膜细胞MMP-9 mRNA表达，且存在明显的剂量依赖关系，组间差异有统计学意义(F=24.31，P<0.05)。结论：IL-17能够上调人滑膜细胞MMP-9基因的表达，在关节局部炎性机制中可能发挥重要作用。

　　【关键词】 白细胞介素-17; 基质金属蛋白酶-9; 滑膜细胞

　　[Abstract]　ob[x]jective： To investigate the effect of interleukin-17 on gene ex[x]pression of matrix me[x]talloproteinase-9(MMP-9) in human fibroblast-like synoviocytes. Methods： Synoviocyte were isolated from synovial tissues of patients with meniscus injury (n=8) and stimulated with recombinant IL-17 for 12， 24 h and 36 h. The ex[x]pression of MMP-9 mRNA in human fibroblast-like synoviocytes was determined by real-time PCR. Results： The isolated cells accorded with the characteristics of fibroblast-like synoviocytes.The MMP-9 mRNA ex[x]pression in human fibroblast-like synoviocytes which were stimulated by 10 ng/ml IL-17 increased in 12 h， peaked in 24 h， then decreased significantly after 36 h (F=16.06，P<0.05). IL-17 could up-regulated the MMP-9 ex[x]pression in human fibroblast-like synoviocytes stimulated by 1,10 and 20 ng/ml IL-17 for 24 h，and the ex[x]pression level was dose dependent (F=24.31，P<0.05). Conclusion： IL-17 may play an important role in the development of joint inflammation via up-regulating the MMP-9 ex[x]pression.

　　[Key words]　interleukin-17; matrix me[x]talloproteinase-9; fibroblast-like synoviocytes

　　白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)主要是T细胞亚群Th17细胞产生的细胞因子，具有很强的致炎性，能促进中性粒细胞释放肿瘤坏死因子(TNF-α)、IL-1、IL-6，刺激滑膜细胞释放前列腺素E2(PGE2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，诱导关节软骨细胞合成氧化亚氮(NO)等生物学功能[1-2]。但其对滑膜细胞基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的调节目前报道较少，本研究通过培养正常人原代滑膜细胞，应用不同浓度重组人IL-17刺激，观察IL-17对人滑膜细胞MMP-9基因表达的影响，以期为进一步探讨MMP-9在关节局部炎症发生中的作用提供依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　对　象

　　收集2010年3至4月江苏大学附属医院在关节镜下所取的正常成人膝关节外伤性半月板损伤的滑膜组织(8例)，其中男5例，女3例，平均年龄28.6岁，术前3周内未使用免疫抑制剂并且无自身免疫性疾病。以上标本获取时都得到患者术前的知情同意。

　　1.2　主要试剂

　　荧光标记的抗体：重组人IL-17(Peprotech公司);FITC标记的抗人CD14、PE标记的抗人CD90(EBioscience公司);胎牛血清、DMEM培养液(Gibco);胰蛋白酶(Sigma公司);RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen公司);逆转录及定量PCR试剂盒(TaKaRa公司);引物由上海生工生物技术有限公司合成。

　　1.3　方　法

　　1.3.1　人滑膜细胞的分离与培养

　　将取下的滑膜组织用含抗生素(青霉素100 U/ml，链霉素100 U/ml)的PBS冲去血迹，剪碎成1 mm3的小块，以间距5 mm左右放入培养瓶内，再把培养瓶放置于37℃，5%CO2的孵育箱内，待4 h后组织小块贴附，缓缓加入1 ml含10%胎牛血清的DMEM培养液，24 h后补加4 ml培养液。2 天后换培养液，除去未贴壁的组织块。以后2～3天换液1次，待细胞生长至培养瓶底面85%面积时，即可消化传代。

　　1.3.2　滑膜细胞类型鉴定

　　用倒置显微镜进行形态学观察并拍照。流式细胞术表面标志鉴定：取第3～5代的成纤维样滑膜细胞，消化后，PBS洗涤，分别与FITC标记的鼠抗人CD14、PE标记的CD90单克隆抗体及对应的同型对照抗体于室温孵育15 min，洗涤细胞，采用BD FACS Calibur流式细胞仪进行检测，结果分析应用Cellquest软件。

　　1.3.3　IL-17对滑膜细胞的作用

　　取第3～5代培养的人滑膜细胞，消化后分为2份，均以5 ×104 个细胞/孔传代于24孔板中，每孔加含10%胎牛血清的DMEM培养液500 μl，置于37 ℃，5%CO2孵育箱中培养12 h，待细胞贴壁。其中一份加入IL-17，使其终浓度分别为1,10,20 ng/ml，置于37℃，5%CO2孵育箱中继续培养24 h。另一份加入IL-17，使其终浓度为10 ng/ml，置于37℃，5%CO2孵育箱中分别继续培养12,24及36 h。

　　1.3.4　细胞总RNA的提取及逆转录反应

　　采用Trizol试剂提取各组细胞总RNA，取总RNA 2 μg进行逆转录反应合成cDNA，均按试剂盒说明书操作。

　　1.3.5　定量PCR检测MMP-9 mRNA表达

　　取上述cDNA，采用TaKaRa 公司SYBR? Premix Ex Taq?试剂盒进行实时荧光定量PCR反应，总反应体系为20 μl，严格按试剂盒说明书操作。引物由上海生工生物工程公司合成，MMP-9基因及内参引物序列。表达水平以其与内参β-肌动蛋白的比值表示，所用定量PCR仪型号为罗氏Lightcycler。MMP-9基因及内参引物序列。

　　2　结　果

　　2.1　滑膜细胞的体外培养及鉴定

　　采用组织块法培养滑膜细胞，培养6天后在其边缘有椭圆形、三角形或梭形成纤维样细胞长出(图1A),20天左右细胞生长至培养瓶底面85%面积，消化传至3～5代的细胞生长迅速，细胞为长梭形、形态均一、排列规则(图1B)。用两种特异性细胞分化抗原CD14，CD90标记后，经流式细胞仪检测发现：这些细胞均一地表达CD90(>95%)、而不表达CD14(<1.3%)，表明所培养的细胞是滑膜成纤维细胞。

　　2.2　不同浓度IL-17对滑膜细胞MMP-9 mRNA表达的影响

　　取第3～5代培养的人滑膜细胞，加入1,10，20 ng/ml 的IL-17共培养24 h后检测MMP-9 mRNA表达。结果发现，与对照组(不加IL-17)相比，3种浓度的IL-17均能上调MMP-9的表达，随着IL-17浓度的增加，MMP-9的表达水平也逐渐增加，呈现明显的剂量依赖效应(F= 24.31，P<0.05)。　滑膜细胞体外分离、培养及鉴定*：设对照组MMP-9表达量为1　不同浓度IL-17对滑膜细胞MMP-9 mRNA相对表达量的影响

　　2.3　IL-17诱导滑膜细胞不同时间MMP-9 mRNA表达量

　　为动态观察IL-17对滑膜细胞MMP-9 mRNA表达的影响，固定IL-17浓度为10 ng/ml，培养12,24,36 h后收集细胞检测MMP-9 mRNA表达。结果发现作用12 h后MMP-9 mRNA表达即增加，24 h到达高峰，36 h后明显下降(F=16.06 ，P<0.05)。*：设对照组MMP-9表达量为1　IL-17诱导滑膜细胞不同时间MMP-9 mRNA表达量

　　3　讨　论

　　近年研究发现一些细胞因子和多肽生长因子在关节软骨和滑膜的正常结构及功能的维持方面起着重要作用，促炎因子与抑制炎症的因子之间保持着平衡，一旦这种平衡发生偏移则可导致疾病的发生。IL-17被认为有较强的促炎作用，尤其是发现一群分泌IL-17的CD4+细胞并命名为Th17细胞之后，其在关节局部炎症中的作用再次成为研究热点[3-5]。

　　本研究在前期发现类风湿关节炎患者外周血Th17细胞明显增多的基础上[6]，进一步探讨IL-17在关节炎症局部的促炎作用。本实验用组织块法培养滑膜细胞，操作简单，换液次数少，减少了污染的机会。通过多次贴壁，可得到较纯的滑膜成纤维样细胞。近年研究证实细胞因子分泌异常，并导致基质金属蛋白酶及其抑制剂的失衡是骨关节炎关节软骨变性的重要原因之一[7-8]。我们采用重组的人IL-17细胞因子，作用于纯化的滑膜成纤维样细胞，观察其对滑膜细胞分泌MMP-9的影响。结果发现，滑膜细胞在没有IL-17刺激的情况下表达少量的MMP-9，在IL-17存在的情况下，MMP-9表达增多，且随着IL-17浓度的升高，MMP-9表达明显增多，表明IL-17与MMP-9 mRNA的表达呈剂量依赖关系。动态观察结果发现，IL-17作用12 h后MMP-9 mRNA表达即增加，24 h到达高峰，36 h后则明显下降。IL-17对关节软骨作用的可能机制，一是IL-17作用于滑膜细胞，促进滑膜细胞分泌细胞因子及基质金属蛋白酶如MMP-9，两者再作用于关节软骨细胞，造成关节软骨的破坏。文献报道IL-17受体缺乏的大鼠与对照组相比，在同样的关节炎诱导条件下，前者软骨细胞的死亡及软骨表面侵蚀明显受到抑制，其滑膜细胞表达IL-1，MMP-3、9、13也减少[9]，间接证明了IL-17促进MMP-9基因表达的重要作用。二是IL-17直接作用于关节软骨，导致其功能障碍[10]。Lubberts等[11]研究发现，向正常小鼠的膝关节单独注射IL-17，足以引起软骨损伤，并且还能加重滑膜炎和关节破坏，用抗IL-17血清中和胶原诱导关节炎小鼠体内的IL-17，能明显减轻滑膜炎的发病程度。

　　本研究仅探讨了IL-17对正常人滑膜细胞表达MMP-9的调节作用，下一步实验将探讨其对骨关节炎或类风湿关节炎滑膜细胞产生各类MMPs的调节机制，以期为全面了解IL-17在关节炎症局部的作用提供依据。