人类白细胞抗原-DRB基因多态性与支气管哮喘易感性的相关性研究

高金明　林耀广　邱长春　马毅

　　【摘要】　目的　探讨人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen, HLA)-DRB基因型在北京地区支气管哮喘患者中的分布。方法　采用序列特异性引物聚合酶链反应研究了HLA-DRB的等位基因在50例哮喘患者和80例健康者间的分布；放射变应原吸附试验荧光酶标法(RAST)测定了哮喘患者的总IgE(TIgE)，户尘螨特异性IgE(d1 sIgE)；乙酰甲胆碱(Mch)支气管激发试验。结果　HLA-DR6(13)基因频率在哮喘组(17%)明显高于对照组(4.3%，P<0.01); DR52基因频率在哮喘组(50%)也明显高于对照组(17.5%, P<0.01), 相对危险度分别(RR)为7.55、4.7。而DR2(15) 基因频率在哮喘组(7%)则低于对照组(18%, P<0.01); DR51基因频率(2%)亦明显低于对照组(33.8%, P<0.01)。HLA单体型DR6(13)-DR52在哮喘组(20%)显著高于对照组(4%, P<0.01), RR为 6.4。70% DR6(13)及56% DR52阳性个体血清d1 sIgE≥4级；27% DR6(13)及28% DR52阴性个体血清d1 sIgE≥4级。HLA-DRB等位基因与TIgE及气道高反应性间无阳性关系。结论　提示DR6(13), DR52为哮喘的易感基因；DR2(15), DR51可能是哮喘发病的抗性基因。DR6(13), DR52基因与d1 sIgE抗体产生有阳性关系，与TIgE及气道反应性则无关。 　　【关键词】　哮喘　　基因，MHCⅡ类　　HLA抗原

　　HLA-DRB alleles polymorphism in susceptibility to asthma in Beijing Chinese　Gao Jinming, Lin Yaoguang, Qiu Changchun, et al. Department of Respiratory Disease, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union Medical College, Beijing 100730
　　【Abstract】　ob[x]jectives　To investigate whether susceptibility or resistance to asthma associated with HLA-DRB alleles and analyze the relationship between HLA-DRB genes and clinical phenotype of asthma (TIgE, sIgE, BHR). Methods　Using PCR-SSP(sequence-specific primer polymerase chain reaction), we tested the frequency distribution of HLA-DRB alleles in 50 asthmatic patients and 80 healthy volunteers from Beijing China. All patients had their serum TIgE, IgE antibody specific to house dust mite measured by RAST, bronchial responsiveness assessed by methacholine bronch-provocation (if FEV1% ≥70%), and broncho-dilation measurement by inhaling salbutamol. Results　There was significantly increased gene frequency of alleles DR6(13), DR52 in asthmatics compared with normal controls (17% vs 4.3%, P<0.01; 50% vs 17.5%, P<0.01), and RR was 7.55 and 4.7 respectively. The frequency of DR2(15), DR51 was lower in asthmatics than in controls (7% vs 18% P<0.01; 2% vs 33.8% P<0.01). The percentage of HLA haplotype DR6(13)-DR52 was higher in asthmatics than in healthy volunteers (20% vs 4%, P<0.01, RR 6.4). 70% of individuals sharing DR6(13) gene and 56% of subjects carrying DR52 gene had elevated serum d1 sIgE antibody (≥+4). There was no relationship between HLA-DRB alleles and total IgE, BHR. Conclusions　Alleles DR6(13), DR52 are significantly implicated in their susceptibility to asthma, at least they may be closely associated with this disorder. Conversely DR2(15), DR51 alleles might confer protection against asthma. Positive associations between DR6(13), DR52 and IgE response to d1 allergen are noted. HLA-DRB genes are particularly involved in regulating human atopic immune response.
　　【Key words】　Asthma　　Genes, MHC classⅡ　　HLA antigens

(Natl Med J China, 1998, 78：591-594)

　　支气管哮喘(简称哮喘)其发病涉及了遗传、免疫、环境等诸多因素。CD4＋T淋巴细胞在哮喘发病中占重要地位［1］。 而CD4＋T淋巴细胞激活的关键取决于HLA II类分子、抗原性肽、T-细胞受体(T-cell receptor, TCR)三者之间的相互作用［2］。过敏性哮喘另一特点为外界抗原进入呼吸道，个体产生针对过敏原的sIgE，继而导致哮喘的临床症状。哮喘可以累及一个家庭中的连续几代人，并且单卵双生子较双卵双生子哮喘的一致发生率高。通过微卫星(microsatillate)DNA多态性连锁分析的方法，已在几条染色体上定位了与哮喘表型相关的特殊基因座位［3］。 　　本研究用分子生物学的方法，探讨了HLA-DRB基因型在北京地区汉族哮喘患者中的分布，同时分析了HLA-DRB基因型与哮喘表型(TIgE、sIgE、BHR)间的关系。
对象与方法
　　一、对象 　　50例哮喘患者，男19例，女31例，平均年龄39.3岁,平均病程14.4年，其中15例(30%)患过敏性鼻炎，均来自于我院门诊、急诊及病房，排除风湿性疾病、高血压、糖尿病以及其它与组织相容抗原相关性疾病，哮喘的诊断符合1993年制定的标准。所有患者均为汉族需完成以下内容的调查问卷及检查：过敏史；皮肤划痕试验是否阳性；哮喘的症状(胸闷、气短、喘息、咳嗽等)；TIgE及sIgE(户尘螨过敏原d1)测定；肺功能、乙酰甲胆碱(Mch)支气管激发试验(若FEV1≥70%)、舒张试验。并除外其它如肺部、心脏疾患。80例对照组均为我院健康献血员、职工。男25例，女55例，平均年龄45.5岁，除外本人及家族过敏史。 　　二、方法 　　1.sIgE, TIgE的检测：取外周静脉血分离出血清，用RAST作sIgE, TIgE的测定(瑞典Parmacia公司)。TIgE正常值为<300IU/L, d1 sIgE以分级表示(0级到6级), 正常值为<3级。 　　2.PCR-SSP法扩增HLA-DRB等位基因：(1) 采用标准的酚-氯仿法提取基因组DNA；(2) PCR反应体系：在0.5 ml Eppendorf管中依次加入以下试剂，4dNTP 1 μl, 2.5 μl缓冲液，DNA聚合酶(上海复华公司)0.5U，消毒去离子水16.5 μl，3′-引物及5′-引物各1 μl(根据HLA-DR位点等位基因所编码蛋白质第二外显子的不同设计出特异性引物，由中国医学科学院分子生物学国家重点实验室提供)，模板DNA 1 μl。加2滴石蜡油覆盖反应物表面,混匀，离心；(3) 循环条件：预变性 94 ℃ 2分钟，变性94 ℃ 40秒，复性54 ℃ 45秒，延伸 72 ℃ 40秒。在PCR自动循环仪上完成30个循环后，后72 ℃延伸5分钟，迅速冷却；(4) 结果鉴定：PCR反应结束后，取扩增产物6 μl，加载样缓冲液2 μl，在含有0.5 μg/ml乙锭的2％琼脂糖凝胶中电泳(100V，20分钟)于紫外灯下观察结果。
　　三、统计学方法
　　HLA-DRB各基因亚型采用直接计数法。HLA-DRB基因频率＝阳性基因数/样本数×2(而DR51，DR52, DR53阳性率＝阳性基因数/样本数)。哮喘组与对照组HLA-DRB基因频率间的比较采用卡方检验或YATE′S校正法。相对危险度(RR)按Woolf或Haldane公式计算。
结　　果
　　一、临床资料 　　50例哮喘患者中，41例对屋尘螨过敏(即RAST+，下同)，17例(34%)对粉尘螨过敏，19例对霉菌过敏。19例进行了支气管激发试验，18例阳性，其他患者因FEV1低于70%预计值未行该试验。所有患者均进行了舒张试验，皆为阳性。平均Mch吸入量0.64 μmol/L。50例哮喘患者第1秒用力呼气(ΔFEV1%)为67.5%。23例患者TIgE升高(≥300 IU/L)，均值578 IU/L。 　　二、HLA-DRB等位基因在哮喘及对照组间的频率分析 　　在哮喘组HLA-DR6(13)及-DR52基因频率(17%、50%)较对照组(4.3%、17.5%)明显增高(表1)，RR分别为7.55、4.7。
表1　哮喘及对照组HLA-DRB等位基因的分布(例数)
 

组别 例数 HLA-DRB等位基因
DR1 DR2(15) DR2(16) DR3 DR4 DR5(11) DR5(12) DR6(13) DR6(14)
哮喘组 50 1 7*
5 7 4 5 5 17**
7
对照组 80 2 27
13 6 9 9 12 7
7
　 　 DR6 DR7 DR8 DR9 DR10 DR51 DR52 DR53 　
哮喘组 50 13 8
7 12 4 1△ 25△△ 24 　
对照组 80 14 18 9 24 3 27 14 42 　

　　△与对照组比较P＜0.005；△△与对照组比较P<0.005 * 与对照组比较P<0.05，**与对照组比较P<0.005

表2　哮喘患者不同血清TIgE水平HLA-DRB等位基因的分布(例数)
 

组别 HLA-DRB等位基因
DR1 DR2(15) DR2(16) DR3 DR4 DR5(11) DR5(12) DR6 DR6(13)
TIgE≥300 IU/L 1 4 1 4 3 2 2 6 8
TIgE＜300 IU/L 0 3 4 3 1 1 3 7 9
　 DR6(14) DR7 DR8 DR9 DR10 DR51 DR52 DR53 　
TIgE≥300 IU/L 3 2 4 7 1 0 12 9
TIgE＜300 IU/L 4 5 3 5 1 0 13 14

　　两组比较P>0.05
　　HLA单体型DR6(13)-DR52的频率在哮喘组(20%)显著高于对照组(4%，P<0.01), RR为6.4。 　　三、HLA-DRB等位基因与哮喘临床表型的关系
　　70% DR6(13)及56% DR52阳性个体血清d1 sIgE≥4级；27% DR6(13)及28% DR52阴性个体血清d1 sIgE≥4级，两组比较差异具有统计学意义。 　　气道高反应性个体在HLA-DR6(13)阳性组(33%)和HLA-DR6(13)阴性组(36%)间分布差异无显著意义(P>0.05); 其它基因型与气道高反应性间亦无关联。HLA-DRB各亚型与哮喘患者血清TIgE间无关系（表2）。
讨　　论
　　目前，大多数学者认为，哮喘是一种多基因病。国际HLA组织以家系为基础的研究也证实了HLA Ⅱ类基因与尘螨诱导的哮喘间的关系［4］。我们的研究表明，本组哮喘患者中DR6(13), DR52基因频率明显增高，而DR2(15)和DR51的基因频率则明显降低。因DR6(13)和DR52基因共处同一单体型，紧密连锁致使二者频率共同增高，提示该单体型为哮喘发病的易感型或至少存在一个易感基因与之紧密连锁。DR2(15)和DR51基因又共处于另一单体型，此二亚型遗传时紧密连锁，其频率在哮喘组明显下降，提示可能为哮喘的抗性基因。我们的结论证实了不同的HLA-DRB等位基因及其产物涉及了哮喘发病这一假设。 　　Blumenthal等［5］的研究表明，HLA-B7, SC31, DR2为花粉相关哮喘的易感基因，HLA-B8, SC01, DR3则为保护性基因。Hsish等［6］研究发现，台湾哮喘儿童的发病与HLA-DQw2相关。Aron等［7］报道，哮喘患者中DR4, DR7的频率较对照组明显升高，并且在一个哮喘大家系中证实了这一结果。认为DR4基因与哮喘患者的发病密切相关。Mulkury等［8］认为DQ2为阿斯匹林哮喘(Aspirin-induced asthma, AIA)的标志基因。但Lympany等［9］在英德两国AIA患者中的研究未能证实此结果，却发现DPB1*0401基因频率在患病组较对照组明显下降，认为该基因为AIA的抗性基因。有学者采用PCR-SSP, -SSOP的方法未能证实哮喘与HLA-DRB等位基因间的关系［10］。我们的结果与其他作者结果不一致的原因为不同种族有着不同的遗传背景。 　　第11届国际HLA组织在13个民族1006名特应质个体研究表明，HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB5基因产物能限制户尘螨抗原决定簇的识别［11］，我们的研究发现，HLA-DR6(13), DR52与d1 sIgE间存在明显的关系。Young等［12］研究了83名特应质及哮喘家族431名个体，结果显示DR1与FeldI（猫毛过敏原）sIgE有阳性关系，DR4与Alta I（霉菌过敏原）sIgE间亦存在联系，受累姊妹间存在HLA单倍型聚集这一现象更加支持HLA Ⅱ类基因对机体特异性免疫应答的调控作用。寻找调控TIgE和气道高反应性基因是目前研究的热点。有文献报道，在以家系为基础的研究认为，在第5号染色体及第11号染色体分别存在调控BHR及TIgE的基因。Amelung 等研究了第6号染色体短臂(6p)上多态性标记D6S105(距HLA-DR基因6cM)，未发现第6号染色体上存在调控气道高反应性和TIgE的基因［13］。 　　不同的HLA-II基因产物识别不同的抗原分子的特殊表位(epitope)进而激发机体的免疫应答反应这一假设，已为目前的研究结果所证实。有研究认为，哮喘发病还与HLA-DP, -DQ基因及TCR基因相关，应指出哮喘虽具有遗传倾向，但环境因素绝不容忽视。
参考文献
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　4　Blumental MN, Caraballo L, Cookson W, et al. HLA-li[x]nked susceptibility to house dust mite-induced asthma. J Allergy Clin Immunol, 1997, 99(1 Pt 2): s338.
　5　Blumenthal MN, Mercus-Bagley D, Awdeh Z, et al. HLA-DR2 (HLA-B7, SC37, DR7) and (HLA-B8, SC01, DR3) haplotypes distinguish subjects with asthma from those with rhinitis only in ragweed pollen allergy. J Immunol, 1992, 148: 415-416.
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