宫颈癌不同临床分期放疗抗拒与缺氧诱导血管新生的关系

作者：戴钰辉,李小娟　　作者单位：河北省河北北方学院附属医院放射科
　　【摘要】 目的：探讨不同临床分期的宫颈癌放疗抗拒与肿瘤缺氧诱导血管新生的关系及意义。方法　选取91例不同临床分期的宫颈鳞癌放疗患者，采用免疫组织化学SP法检测乏氧细胞诱导因子(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)，并用CD105标记新生微血管密度(MVD)。结果　随着临床分期的加重，肿瘤的放疗抗拒增大。VEGF、HIF-1α在宫颈鳞癌Ⅱb～Ⅳ期放疗后抗拒的阳性表达率升高，差异有统计学意义(P<0.05)。HIF-1α、VEGF与MVD在不同临床分期之间存在正相关，且随临床分期的加重，MVD的计数逐渐增加，差异有统计学意义(P<0.05)。结论　随着宫颈鳞癌的临床分期加重，肿瘤的放疗抗拒加重，HIF-1α、VEGF、MVD的表达与之相关，可作为宫颈鳞癌放疗后判断预后的可靠依据。
　　【关键词】 肿瘤血管新生;HIF-1α;VEGF;放疗抗拒

　　【Abstract】　ob[x]jective　To investigate the relationship and significance between radiotherapy resistance and angiogenesis induced by hypoxia in patients with cervical squamous cell carcinoma (SCC) at different clinical stages.Methods　91 patients with cervical SCC at different clinical stages who were treated by radiotherapy were enrolled in the investigation.The immunohistrochemical assay was used to detect the ex[x]pressions of HIF-1α，VEGF，COX-2，and microvessel density (MVD) was marked by CD105.Results　The radiotherapy resistance of cervical SCC was increased with the aggravation of clinical stages.The positive ex[x]pression rates of VEGF，HIF-1αat Ⅱb-Ⅳ stages after radiotherapy were significantly increased (P<0.05).There was a positive correlation between HIF-1α，VEGF and MVD at different clinical stages，furthermore，the count of MVD was gradually increased with the aggravation of clinical stages，and there was a significant difference (P<0.05).Conclusion　The radiotherapy resistance of cervical SCC is increased with the aggravation of clinical stages.There is a positive correlation between HIF-1α，VEGF，MVD and different clinical stages，which can be used as the reliable evidence for evaluating the prognosis of patients with cervical SCC after radiotherapy.

　　【Key words】　tumor angiogenesis;HIF-1α;VEGF;radiotherapy resistance

　　试验显示，肿瘤乏氧对放射治疗不敏感，而肿瘤血管的新生又可促进乏氧细胞再氧合，进而部分缓解肿瘤细胞缺氧情况，但其在放疗抗拒中所扮演的角色仍然不清楚[1]。乏氧细胞诱导因子(HIF-1α)是缺氧条件下存在肿瘤内的一种转录因子，可直接调控血管内皮生长因子(VEGF)的表达[2]，促进肿瘤血管新生。本试验采用免疫组化SP法检测HIF-1α、VEGF，用CD105标记微血管密度(MVD)，研究不同临床分期的宫颈鳞癌放疗抗拒与缺氧诱导肿瘤血管新生的关系，以期为临床放疗宫颈鳞癌提供可靠依据。
　　1　资料与方法
　　1.1　一般资料
　　收集河北北方学院附属医院2007年1月至2009年12月宫颈鳞癌放疗病例91例，年龄26～68岁，平均年龄46岁;临床分期(FIGO)按2000年标准，Ⅱb期34例，Ⅲ期39例，Ⅳ期18例。放疗前均经病理证实。
　　1.2　方法

　　患者均采用直线加速器外照射全盆腔，总量DT50Gy/25次/5周 (DT30～35 Gy时中线遮挡4 cm);3周时，高剂量率内照射(铱-192)，DT 5～7 Gy/次，1周1次/5～7周。A点剂量：内照射2/3、外照射1/3;B点剂量内照射1/3，外照射2/3。放射治疗前，患者均经宫颈取材SP法免疫组化，病例医师阅片、核实、诊断。
　　1.3　试剂

　　兔抗人HIF-1α、VEGF多克隆抗体、抗CD105单抗体，SP法试剂盒，MVD计数法。
　　1.4　判定标准

　　判定HIF-1位于细胞核，阳性细胞核染成棕黄色(图1);VEGF为细胞质内，染成棕黄色(图2);阳性细胞(10个高倍视野)的着色强度按无着色、黄色、棕黄色和棕褐色分别判为0、1、2、3分，0～2分为低表达，视为阴性，3～6分为高表达，视为阳性。根据1979年WHO(World Health Organization)实体瘤近期客观疗效标准测量病变，完全缓解、部分缓解评定为放疗敏感，无变化、恶化评定为放疗抗拒。MVD判定按照Weinder报道方法，高倍镜下(×100)计数CD105抗体阳性的血管数目(图3)，任何与附近微血管，肿瘤细胞及其他结缔组织明显分离的褐染的内皮细胞或内皮细胞簇均被认为是单个的微血管，计数5个100倍视野下的血管数目，结果用平均数表示。,图1　HIF-1α表达于子宫颈鳞状细胞癌胞浆(SP×200),图2　VEGF表达于子宫颈鳞状细胞癌胞浆(SP×200),图3　子宫颈鳞状细胞癌周围微血管密度(CD105标记 ×100)1.5　统计学分析　应用SPSS 16.0统计软件，计量资料以x-±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，相关性采用Spearman等级相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2　结果

　　2.1　HIF-1α与VEGF在不同临床分期宫颈癌中表达与疗效的关系
　　在相同临床分期及不同临床分期的宫颈鳞癌中均存在放疗抗拒。随着临床分期的升高，肿瘤的放疗抗拒增大。 HIF-1α在Ⅱb、Ⅲ、Ⅳ阳性率分别是20.6%(7/34)、30.7%(12/39)、50.0%(9/18)，VEGF在Ⅱb、Ⅲ、Ⅳ阳性表达率分别是26.4%(9/34)、46.1%(18/39)、66.7%(12/18)， HIF-1α、VEGF的表达在Ⅱb与Ⅲ、Ⅱb与Ⅳ、Ⅲ与Ⅳ比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。表1　HIF-1α与VEGF在不同临床分期的宫颈鳞癌中的表达与疗效的关系

　　2.2　宫颈癌组织中HIF-1α、VEGF的表达及MVD计数

　　HIF-1α、VEGF伴随临床分期的升高，MVD的计数逐渐增加，不同分期MVD计数差异有统计学意义(P<0.05)。HIF-1α、VEGF阳性表达与MVD计数呈正相关。
　　2.3　三种临床分期中HIF-1α表达、VEGF的表达与MVD计数的相关性
　　HIF-1α表达与VEGF的表达呈正相关性(r=0.648，P<0.05)， HIF-1α表达与MVD计数呈正相关性(r=0.547，P<0.05)，VEGF的表达与MVD计数呈正相关性(r=0.876，P<0.05)。见表2。表2　HIF-1α、VEGF在不同临床分期的宫颈鳞癌中的阳性表达与MVD的关系
　　3　讨论

　　新生血管可为肿瘤生长提供营养和氧，但瘤体新生血管的生长与放疗疗效的关系并不明确。研究显示，瘤体细胞乏氧可诱导HIF-1α、VEGF的表达明显升高，可促进肿瘤血管新生[3]。但同时又有利于抑癌基因(p53)的突变[4]，促使肿瘤细胞过度生长，并抑制了肿瘤细胞的凋亡，有利于肿瘤细胞的生长和侵袭。因此，通过免疫组化染色监测HIF-1α、VEGF和Weinder的方法计数MVD可以作为判断宫颈鳞癌放射治疗后抗拒的重要分子标志物。
　　HIF-1α是缺氧条件下广泛存在于人体的一种异源二聚体转录因子[5]。VEGF是HIF-1α重要的靶基因，其表达基因的转录起始点上游拥有HHIF-1α结合位点，即缺氧反应元件(HRE)[6,7]，可与HIF-1α形成转录起始复合物，从而启动和上调VEGF基因的转录与表达。因而在缺氧环境下VEGF基因的表达上调，及其相应蛋白产物的增加，对放射治疗的抗拒产生了重要影响。
　　近年来，肿瘤分子生物学研究发现，VEGF和血小板源性生长因子(PDGF)在肿瘤血管新生中起重要作用[8]。这些新生的肿瘤血管可为癌细胞的生长和侵袭提供营养和氧，同时电离辐射对细胞的效应却又强烈地依赖于氧的存在，这就产生了一定的矛盾点;本课题组通过免疫组化方法检测新生血管内上的CD105(CD105抗原是一种高度糖基化1型膜蛋白，它存在于新生血管内皮中)来标记肿瘤MVD。本研究结果显示，HIF-1α、VEGF随着宫颈鳞癌临床分期的提高而表达增强，呈正相关关系(P<0.05)，且HIF-1α、VEGF对宫颈鳞癌放疗后的肿瘤血管新生形成正调控。Weinder的方法计数MVD研究显示其同样也伴随着临床分期的增高而增多。表明了不同临床分期宫颈鳞癌患者细胞中HIF-1α、VEGF的表达阳性率的不同以及MVD的增高，可以影响宫颈鳞癌对放疗的敏化程度，进而影响宫颈鳞癌的放射治疗效果[9]。
　　综上所述，宫颈鳞癌是被证实具有多样血管生成能力的人体恶性肿瘤之一。本研究通过监测缺氧诱导因子(HIF)通路的激活及HIF-1α、VEGF的高表达，研究这些综合因素对宫颈鳞癌血管的新生，及这些新生血管所提供的营养和氧对肿瘤的生长侵袭和细胞对放射线敏感性关系的影响，进一步阐明不同临床分期的宫颈鳞癌对放射治疗的抗拒是不同的，缺氧诱导血管生成与宫颈鳞癌抗拒之间确实存在相关关系。同时通过实验数据的结果分析说明，不同临床分期的宫颈鳞癌确实存在着放射治疗敏感性的个体差异性，即需要解决肿瘤放射治疗个体化的问题。也通过这些数据为设计和实施个体化放射治疗方案及放疗前进行个体肿瘤的放射敏感性预测提供极大的帮助，可以进一步提高宫颈鳞癌放疗的疗效，提高宫颈鳞癌患者的5年生存率和生活质量，为今后更深层次的分子生物学研究提供一个新视角。
　　【参考文献】
　　1　余子豪，殷巍伯，徐国镇主编.肿瘤放射治疗学.第4版.北京：中国协和医科大学出版社，2008.232-320.

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　　4　Tseng PL，Tai MH，Huang CC，et al.Overex[x]pression of VEGF is associated with positive p53 immunostaining in hepatocellular carcinoma (HCC) and adverse outcome of HCC patients.Journal of Surgical Oncology,2008,98：349-57.

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