胃肠间质瘤靶向治疗耐药的分子机制及治疗策略

         胃肠(itestinalsriomaltumor,GIST)是胃肠道常见的间叶源性肿瘤由于肿瘤对常规放化疗不敏感，手术切除曾是治疗GIST有效的方法，对于肿瘤进展转移或术后复发而失去手术机会的患者，其中位生存期仅6-18个月，5年生存率小于10%-'-10余年来.随着现代分子生物学技术在GIST临床诊断治疗中的广泛应用，尤其以伊马替尼为代表的分子靶向药物的出现和普及使GIST患者的预后得到显著改善。

         目前，伊马替尼用于治疗晚期G工ST及GIST术后辅助治疗的显著疗效已经得到广泛共识，但同时伊马替尼的原发性和继发性耐药问题也日益受到研究者关注，成为近期GIST研究的热点。本文将伊马替尼等GIST靶向治疗药物耐药的分子机制及相应治疗策略作一综述。

         目前，伊马替尼和舒尼替尼是用于治疗GIST的主要靶向药物，两药分别于2001年和2006年被FDA批准在临床使用。伊马替尼是一种小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitor,TKI)，其主要的分子靶点为kit,PDGFRA和bcr-abl;舒尼替尼的靶点相对前者更丰富，其对kit,PDGFRs,VEGFRs,FLT3和RET均有抑制作用。伊马替尼和舒尼替尼都能作为假底物与ATP竞争性结合KIT/PDGFRA受体的酪氨酸激酶位点，发挥阻滞激酶激活和信号传导的作用，此外，舒尼替尼还具有抗肿瘤血管形成的作用，这可能与其对VEGFR的抑制作用有关，。
         虽然靶向药物的治疗明显改善了GIST的预后，约80%的患者在初接受伊马替尼治疗后获益，但耐药问题也同时成为靶向治疗中的棘手难题。研究发现，有40%-so%的患者在接受伊马替尼治疗后2年内出现耐药，发生伊马替尼耐药的患者如接受舒尼替尼治疗，其无进展生存期(progression-freesurvival,PFS)也只有24.1周一认许多因素与发生伊马替尼或舒尼替尼耐药有关。其中，KIT/PDGFRA的基因突变是决定耐药与否的主要原因，此外可能还涉及基因扩增、杂合性丢失、近膜热点区域之外的旁路激活及药物血浆浓度等原因。根据耐药产生的时间，耐药可分为原发性耐药(早期耐药)和继发性耐药(晚期耐药)，前者是指用药后疾病仍然进展或疾病稳定小于6个月者，后者是指经治疗病情稳定6个月之后再次发生的疾病进展。

         一、基因突变因素 1.KIT/PDGFRA受体分子结构及突变类型:通过对GIST标本基因检测发现，有80%-85%的GIST患者存在。-kit基因突变，另有5%-7%的患者表现为PDGFRA突变，而野生型kit基因只占总数的10%左右，且其中部分野生型kit基因或PDGFRA基因突变的患者，其肿瘤标本免疫组织化学(免疫组化)染色结果也呈KIT阳性表达，GIST患者的。-kit蛋白(CD117)阳性表达率约占总数的95%'S-'。因此不难看出，kit或PDGFRA的异常活化是GIST发生的重要因素。 c-kit及PDGFRA基因都位于染色体4q12位点，它们编码的受体蛋白均属于flI型酪氨酸激酶受体家族，具有相似的蛋白结构，分为膜外配体结合区段(extracellulardomain.EC、跨膜区段、胞内近膜区段(juxtamembraneregion,Jbl)和酪氨酸激酶区段(tyrosinekinasedomain.TK),后者又被一段插人序列分隔为ATP结合功能区(TKl、和磷酸转移酶功能区(TK2),ATP结合功能区是伊马替尼与ATP竞争性结合的区域。 
         正常情况下，kit受体没有活性，其活化需要干细胞因子(stemcellfactor,SCF)的参与SCF是kit受体的天然配体它与kit受体的膜外区段结合后促使受体形成二聚体并使酪氨酸激酶区的酪氨酸残基发生相互交叉磷酸化进而激活其下游信号通路。-kit蛋自在许多细胞如造血祖细胞、肥大细胞和黑色素细胞等细胞表面都有表达，井对这些细胞的正常增殖分化及功能调控起到重要作用在GIST细胞中，由于KIT/PDGFRA基因发生功能获得性突变，相应的受体蛋白可在缺乏配体结合的情况下，发生自发性持续活化并激活下游的PI3K/Akt,RAS/MAPK和JAK/STAT3信号通路，导致肿瘤形成。尤其前两条通路被认为在肿瘤的异常增殖及抗凋亡中起重要作用fii。根据突变发生的部位，引起GIST发生的kit突变类型可分为两大类:受体调控区域突变(包括EC和JM)和酪氨酸激酶区域突变(包括TK1和TK2)。其中，累及11vI的外显子I1突变(占65%-70%)常见，主要表现为基因缺失及点突变。编码EC的外显子9突变占10%}20%，而外显子13(编码TK1)和外显子17(编码TK2)突变更少见川。与kit基因不同，PDGFRA基因突变主要发生在外显子18，突变可影响TK2，改变活化环构象，使受体保持持续活化状态。 2.原发性耐药:有9%}13%接受伊马替尼治疗的GIST患者可发生原发性耐药[A]。这主要与KIT/PDGFRA受体的基因型有关。常见的引起早期耐药的基因型有kit外显子9突变、PDGFRA突变和野生型GIST。外显子9突变引起耐药的原因是由于突变后位阻影响伊马替尼与受体激酶区的牢固结合。加大伊马替尼的使用剂量可以使这部分患者获益。 由于只有5%--7%的GIST患者表现为PDGFRA基因突变，有限的病例数使我们很难对其药物敏感性做出准确地评判。PDGFRA外显子12和14突变患者对伊马替尼治疗敏感，但PDGFRA常见的外显子18突变，尤其是点突变D842V可发生早期耐药。其机制是由于D842V突变使TK2的活化环被打开，kit蛋白保持稳定的活化状态，导致伊马替尼无法与之结合。尽管如此仍有约30%发生PDGFRA突变的GIST患者对伊马替尼治疗敏感，其中甚至还包括部分D842V的患者。其原因还有待进一步研究解释。
        

         此外，野生型GIST也是引起伊马替尼原发性耐药的常见原因。 Agaram等发现，在部分野生型GIST标本中存在BRAF外显子15的V600E突变，该突变可导致RAS/MEK/ERK旁路的异常活化，这种异常突变在许多其他肿瘤组织中也可检测到，如黑色素瘤、结直肠癌等。此外还有研究证实，野生型GIST中IGF1R(insulin-likegrowthfactor1receptor)呈过表达11这些发现均提示，野生型GIST可能存在KIT通路以外的诱发肿瘤途径，这些信号通路异常可能是导致野生型GIST对伊马替尼耐药的原因3.继发性耐药:在持续使用伊马替尼治疗12-36个月后，有50%-70%的GIST患者可再次出现肿瘤进展。在这些患者中，83%的肿瘤标本中可检测到存在继发性基因突变。 与突变位点相对单一的原发性突变不同，继发性突变常呈现为多克隆的多样性突变方式Liegl等「m通过对14例接受伊马替尼或舒尼替尼治疗后耐药的G工ST患者进行基因检测后发现，83%的患者存在基因继发突变，其中67%在不同的转移灶标本内发现2--5处新的突变，另有34%的患者在同一病灶同时存在2种新的突变。 继发性突变多见于原伴有kit外显子11突变的患者(73%)，其次为外显子9突变者(79070)，其他突变的患者发生继发性突变的很少，野生型或kit阴性GIST患者即使接受伊马替尼治疗后亦不发生继发突变[‘3」而且，继发性突变往往发生在kit基因外显子13,14,17或18，即编码kit受体酪氨酸激酶区段的位点，突变方式以点突变常见。发生突变后的kit蛋白或因无法与伊马替尼在TK1区形成稳定的氢键结合(如T670I,Va1654A1a)，或通过TK2区释放活化环，使kit受体保持活化构象影响与伊马替尼结合(如肠r823Asp,D816H/V)，从而产生耐药。 对于继发性耐药的患者，目前舒尼替尼被作为二线治疗药物。对一些伊马替尼治疗不敏感的突变类型，包括外显子9,13,14突变及野生型kit(如KIT-T670I或V654,}1),舒尼替尼具有明显好于伊马替尼的疗效‘“j但涉及编码活化环区域的外显子17和18突变如PDGFRA-D842V的患者，往往对舒尼替尼耐药。与伊马替尼相似，舒尼替尼只能与非活化的kit受体结合，D816或D820等TK2区位点的突变使受体保持自身活化状态而阻止舒尼替尼与之结合并产生耐药。关于引起舒尼替尼继发性耐药的基因突变报道相对较少Heinrich等曾经报道3例kit外显子9突变的GIST患者，在接受舒尼替尼治疗1年后发生继发性的外显子17点突变，分别表现为D820Y,D820E和N822K.
        

         二、其他耐药因素除了基因突变因素，KIT/PDGFRA基因的过表达可能也是部分GIST患者、尤其是野生型GIST发生耐药的因素之。在部分转移性和耐药GIST肿瘤标本中还发现有正常野生型kit等位基因的杂合性缺失，这提示kit位点的杂合性缺失也可能与伊马替尼耐药有关1e此外，KIT/PDGFRA受体以外的信号一通路的异常激活同样可以引起耐药。一些肿瘤相关蛋白如酪氨酸激酶受体AXL,FAK,IGF1R和t%EGF在部分耐药GIST肿瘤标本及细胞株中检测呈高表达;这些均提示，长期使用单一靶向药物治疗可能会诱导激活一些特殊的信号旁路，从而导致肿瘤再次进展但该假设还需进一步的研究证实。 伊马替尼的血药浓度也是预测药物反应性的重要因素。在B2222试验中，Demetri等通过检测使用伊马替尼治疗第29天的GIST患者的血药浓度，发现有25}7}的患者血药浓度低于1100O,g/L，其PFS只有11.3个月，明显低于其余患者的30.6月(P=0.0029);而且，外显子11突变的患者如果用药后病情得到控制(CR加PR加SD).其血药浓度高于1100}g/L因此，一些影p1P]伊马替尼吸收代谢的药代动力学因素，也是研究伊马替尼耐药必须考虑到的文献报道，伊马替尼是一些胃肠道上皮细胞内转运蛋自如BCRP/ABCC孰OCT-1的作用底物，这些转运蛋白的表达异常，可引起伊马替尼耐药.
         三、预防或治疗耐药策略
         1.优化伊马替尼使用方案:目前，基因检测已被作为伊马替尼初次治疗前的常规检查。通过对KIT/PDGFRA常见突变位点的测序，可有效预测GIST患者对伊马替尼的药物敏感性，预防原发性耐药的发生但是，正如前文所述，大部分继发性突变表现为多克隆起源，同一个体的同一病灶内或不同病灶之间常可表现为不同的突变类型。因此，对于这部分患者来说，基因检测的疗效预测作用相对较小此外，伊马替尼使用剂量的个体化也是预防耐药发生的有效手段。                  EORTC/AGITG/ISG62005研究的数据显示，对于伊马替尼400mg/d治疗耐药的患者，增加药物剂量至800mg/d可使其中约1/3患者的病情得到控制，并有200Ic的患者在1年内疾病无进展。尤其对于外显子9突变的患者，大剂量伊马替尼可显著改善预后。一项包括1640例患者的me[x]ta分析结果显示，在接受伊马替尼治疗的外显子9突变的患者中，800m扩d组的PFS明显优于400mg/d组(P=0.017)。前文所述，伊马替尼的血药浓度也与药物的疗效直接相关。因此，有学者建议通过监测伊马替尼血药浓度，发现部分血药浓度过低的患者并增加伊马替尼使用剂量，使体内伊马替尼血药浓度稳定维持于一个高水平区间(如大于1100g/L)，以使药物达到大作用效果，预防耐药发生。但血药浓度检测的临床实用性及可行性还有待进一步研究证实.
         2.新型靶向治疗药物:目前，临床上对于伊马替尼及舒尼替尼均耐药的晚期GIST患者的治疗仍很棘手，新型分子靶向药物的出现为这部分患者提供了新的希望。第2代酪氨酸激酶抑制剂如尼洛替尼(nilotinib)、索拉菲尼(sorafenib)和达沙替尼(dasatinib)等对部分伊马替尼或舒尼替尼耐药的突变方式有效。有n期临床试验报道，对于伊马替尼和舒尼替尼均耐药的GIST患者，尼洛替尼治疗的有效率为10%，有19%的患者经尼洛替尼治疗后病情稳定m。另有报道，作为伊马替尼、舒尼替尼和尼洛替尼均耐药的四线治疗，索拉菲尼的有效率及疾病稳定率分别为19%和44%.
         此外，达沙替尼是目前对PDGFR.4-D842V突变有效的药物除ITKI，一些针对酪氨酸激酶以外的靶向治疗药物也在研制中，如作用于KIT下游mTOR位点的伊维莫司(RAD001)、热休克蛋白90(Hsp90)抑制剂17-AAG等，这些药物虽然在体外实验中均显示了诱人的前景，但临床上均还处于试验阶段.
         3.联合治疗:野生型GIST及GIST对单一靶向药物耐药的异质性均说明，GIST的形成是多途径和多步骤共同作用的结果因此针对KIT/PDGFRA受体的单药治疗无法达到;n愈疾病的目的故有学者提出了针对肿瘤多个位点的多靶同联合治疗，目前正在尝试的方案均以伊马替尼为基础，联合一种新型靶n药物，如TKI抑制剂PKC412、或依维莫司(RAD001)、或热休克蛋白抑制剂等。此外，对于部分用药后局部进展的GIST患者，通过肿瘤减负手术，切除发生耐药的肿瘤组织，术后继续TKI治疗，也可以达到比较满意的疗效一项研究显示，通过治疗，患者的中位PFS可达7.7个月，总体生存率可达29.8个月。但手术患者的选择直接决定了疗效，即手术只适用于局部进展的患者，而对广泛转移的肿瘤无效虽然目前针对伊马替尼及舒尼替尼耐药的治疗方案多种多样，但总体疗效均欠佳，至今也没有新药被批准用于伊马替尼和舒尼替尼耐药的GIST患者的治疗，耐药问题仍是临床上GIST靶向治疗中的棘手难题。

         因此，在现有条件下.更应强调以分子机制为基础的个体化治疗，在了解GIST患者分子学特征的基础上，选取合理的治疗方案。 
         参考文献 
         Frankel TL,Chang AE,Wong SL. Surgical options for localized and advanced gastrointestinal stromal tumors[J].Journal of Surgical Oncology,2011.882-887.
         Gramza AW,Codess CL,Heinrich MC. Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors in Gastrointestinal Stromal Tumors[J].Clinical Cancer Research,2009.7510-7518.
         Mena AC,Pulido EG,Guillén-Ponce C. Understanding the molecular-ba[x]sed mechanism of action of the tyrosine kinase inhibitor:sunitinib[J].Anti-Cancer Drug Design,2010,(Suppl 1):S3-S11.
         Goodman VL,Rock EP,Dagher R. Approval summary:sunitinib for the treatment of imatinib refractory or intolerant gastrointestinal stromal tumors and advanced renal cell carcinoma[J].Clinical Cancer Research,2007.1367-1373.
         Miettinen M,Lasota J. Histopathology of gastrointestinal stromal tumor[J].Journal of Surgical Oncology,2011.865-873.
         Duensing A,Medeiros F,McConarty B. Mechanisms of oncogenic KIT signal transduction in primary gastrointestinal stromal tumors(GISTs)[J].Oncogene,2004.3999-4006.
         Fletcher JA,Rubin BP. KIT mutations in GIST[J].Current Opinion in Genetics & Development,2007.3-7.
van Oosterom AT,Judson I,Verweij J. Safety and efficacy of imatinib(STI571) in me[x]tastatic gastrointestinal stromal turnours:a phase I study[J].The Lancet,2001.1421-1423.