化疗耐药性前列腺癌干细胞的代谢指纹图谱

化学耐药性是癌症治疗中重要的挑战之一。肿瘤内癌症干细胞的存在可能有助于化疗耐药性，因为这些细胞表达高水平的挤出泵和使治疗药物失活的异生代谢酶。尽管癌细胞代谢适应取得了进展，但对化疗耐药的癌症干细胞的代谢适应知之甚少。在这项研究中，我们通过液相色谱-高分辨率光谱法结合细胞毒性测定、蛋白质印迹、定量实时聚合酶链反应 （qPCR） 和脂肪酸氧化在抗抗雄激素 2-氢氟氟酰胺的前列腺癌细胞系中进行非靶向代谢组学分析具有癌症干细胞特征，与其亲本雄激素敏感细胞系相比。代谢指纹图谱显示ESI+的106种代谢物中有850种，ESI中的67种代谢物中有446种，敏感细胞系和耐药细胞系之间存在显着差异。使用明确鉴定的代谢物进行的途径分析揭示了参与能量代谢以及转录后调节的途径的变化。酶表达分析验证表明，化疗耐药前列腺癌干细胞代谢休眠，脂肪酸氧化、蛋氨酸代谢和ADP-核糖基化减少。我们的研究结果揭示了癌细胞进入休眠状态的途径，这可能有助于耐药机制。

前列腺癌 （PCa） 是男性癌症相关死亡的第二大原因，年发病率为 268500 例（占男性所有癌症类型的 27%）（Siegel 等人，2022 年）。根据西班牙肿瘤内科学会 （SEOM） 的数据，PCa 是 2020 年西班牙常见和普遍的恶性肿瘤（Cassinello 等人，2018 年;冈萨雷斯·德尔阿尔巴等人，2021 年）。尽管有高度发达的治疗方法，但以雄激素非依赖性生长为特征的晚期疾病每年增加 4%-6%（Siegel 等人，2022 年）。一旦前列腺癌进展为去势抵抗性前列腺癌 （CRPC），治疗基于雄激素受体抑制和/或抗有丝分裂紫杉烷化疗，以提高患者的生存率（Menges 等人，2022 年）。然而，尽管这种治疗前列腺癌的益处，比预期的要多，但对化疗产生耐药性，然后，化疗的效果受到阻碍，治疗选择有限（Lohiya等人，2016）。目前，化学耐药性的发展是癌症治疗中大的挑战之一。对治疗的耐药性可能是由癌症干细胞（CSCs）的存在引起的，CSCs是肿瘤内具有长期复制潜力，自我更新和多能能力的细胞亚群。

已经描述，前列腺癌干细胞对大多数标准疗法具有抗药性，并且构成了癌细胞克隆扩增的来源，这被认为是导致肿瘤复发的原因（Leao等人，2017;斯克沃尔佐夫等人，2018 年）。CSC通过重新激活诱导周围细胞增殖和干细胞可塑性的信号通路和适应性代谢网络来维持肿瘤生长。CSCs感知能量需求和营养供应，并显示出与其他肿瘤细胞不同的代谢途径。代谢重编程是癌症的标志，它允许肿瘤细胞满足快速细胞生长、侵袭和转移所需的增加的能量需求。值得注意的是，代谢重编程可防止癌细胞因化疗引起的死亡而导致癌症耐药性。这在前列腺癌中尤其重要，其中脂质信号失调会促进生长和肥胖，并被描述为与晚期或致命前列腺癌密切相关的危险因素（Pernar等人，2018）。累积的证据表明，CSC的代谢适应与散装癌细胞中的代谢适应不同，与正常组织干细胞中的代谢适应非常相似（Kim，2019）。此外，诱导CSC的改变分化信号可能由参与干细胞命运调节的代谢事件控制（Menendez和Alarcon，2014）。例如，一些代谢物可以调节表观遗传变化，包括参与基因表达控制的组蛋白甲基化和乙酰化（Shyh-Chang和Ng，2017）。然而，对化疗耐药的CSC的代谢特征仍然难以捉摸。

代谢组学旨在使用化学计量学和统计工具来检测、鉴定和量化生物样品中的所有代谢物，以比较取决于遗传和环境因素的不同生理条件的代谢指纹或代谢物谱（Dieme 等人，2017 年）。代谢组学提供有关特定条件下生物系统的生化状态或代谢组的信息。该方法允许了解细胞，组织或生物体液中存在的低分子量化合物，这些化合物参与维持，生长和细胞正常功能所需的不同代谢途径（Fiehn，2002;张等， 2014;徐等人，2021 年）。此外，代谢谱随时间变化，并在疾病的不同阶段发生变化。代谢组学已开始应用于CSC研究，因为它可以显示能量状态，细胞增殖和适应性，以及干细胞命运选择，例如自我更新与分化（Sun等人，2019）以及细胞与其环境之间的串扰（Bispo等人，2021）。

细胞、组织或生物流体中代谢物的检测通常使用先进的分析技术进行，如核磁共振 （NMR） 波谱（Sciarra 等人，2011 年;利马等人，2018 年;范德格里夫特等人，2018）或质谱法（MS）（Zang等人，2014;塞格斯等人，2019 年;Sun 等人，2022 年）已成功应用于前列腺癌研究。一般来说，核磁共振波谱和质谱，特别是液相色谱-高分辨率质谱（LC-HRMS），是代谢组学研究中重要的两个分析平台。这两种技术都提供了大量数据，需要统计分析来提取有关代谢反应的相关和可靠的信息。主要挑战之一是任何代谢组的复杂性，而“非靶向策略”适合建立生物系统中存在的代谢物的完整概况（“代谢指纹”）（Alonso等人，2015）。与核磁共振相比，MS的优势在于检测低得多浓度的代谢物的灵敏度更高，并且更适合高通量方法。此外，近年来，LC-HRMS技术由于其鲁棒性和分辨率能力而越来越多地被使用。测定检测到的离子的质量/电荷比（m / z）的高分辨率以及MS中的专用数据库允许搜索未知化合物并初步鉴定存在的代谢物。因此，今天LC-HRMS是进行代谢组学研究的佳分析工具（Jayaraman等人，2018;马丁-布拉兹克斯等人，2019 年;平托等人，2020 年）。

在这里，我们使用使用LC-HRMS的代谢组学方法，使用显示CSC特征的癌细胞耐药模型来了解与化疗耐药性相关的适应性反应。我们对代谢指纹图谱和酶分析的综合分析发现，耐药细胞具有低代谢率，其特征是低ADP-核糖基化和甲基化以及低线粒体脂肪酸β氧化。前列腺耐药细胞中已确定的代谢途径将允许开发针对获得耐药性所涉及的机制的有效治疗策略，值得进一步研究。

讨论

化学耐药性是前列腺癌治疗中具挑战性的困难之一。化疗耐药性癌症的高患病率使得我们迫切需要加深对化学耐药机制的理解并开发新的治疗策略。在化学耐药性的机制中，存在具有独特性质的癌症干细胞，包括高多重耐药转运蛋白表达，以及即使在化疗药物存在下也能维持肿瘤的自我更新能力。然而，虽然代谢重编程现在被认为是癌症的标志（Fouad和Aanei，2017），但对CSCs可塑性背后的代谢途径知之甚少，CSCs能够处于休眠状态，并且能够在需要重新填充肿瘤块时迅速增殖（Mancini等人，2018）。

癌症干细胞是前列腺肿瘤中的一个重要亚群，主要负责抗雄激素治疗耐药性。在一项针对去势抵抗性前列腺癌患者的表观遗传和转录组学研究中，Tang 等人（Tang 等人，2022 年）根据其谱系可塑性和所涉及的转录因子确定了四个亚组。他们发现了一种干细胞样（SCL）亚型，这是第二普遍的群体，并且与对新一代雄激素受体抑制剂的反应较差有关。有趣的是，这些SCL肿瘤是阴性的或AR表达低（Tang等人，2022）。在另一项研究中，Han 等人发现了一种干细胞样 PCa 亚型的转移性去势抵抗性前列腺癌，该亚型由 AR 阳性细胞引起，这是恩杂鲁胺阻断和治疗诱导的谱系可塑性的结果（Han 等人，2022 年）。在这项研究中，我们使用了适合在抗雄激素2-羟基氟他胺存在下生长的前列腺癌细胞系，该细胞系显示出干细胞的特征，例如泵的增强表达，该泵将细胞内积聚的药物外排，ABCB1A，多能因子Nanog和Yamanaka因子Oct4的表达增加，以及AR水平低。值得注意的是， 这些细胞对化疗药物氟他胺和多西紫杉醇的敏感性较低，因此是研究与癌症化疗耐药性相关的代谢变化的良好模型。

越来越多的证据表明，脂质和氨基酸代谢改变与肿瘤的耐药性密切相关（Yang等人，2022 年）。有报道称，转移性卵巢癌干细胞表现出与原发性肿瘤不同的脂质模式。这些细胞依靠脂肪自噬来利用脂质，而不是传统的脂解途径，并且与原发性肿瘤相比，积累了许多细胞质脂滴和脂质囊泡（Sandeep 等人，2022 年）。同样，造血干细胞依靠线粒体脂肪酸β氧化来调节分化。在对称分裂中自我更新的细胞具有更高水平的蛋白质参与粮农组织，而在不对称分裂中分化的细胞具有较低的水平（Ito等人，2016）。我们的结果显示，与亲本细胞相比，抗癌干细胞样细胞中的脂肪酸β氧化减少，这表明它们可能正在经历不对称分裂以维持增殖的肿瘤细胞。

癌细胞因其高所需的蛋氨酸水平而与众不同，这一事实被称为蛋氨酸成瘾或霍夫曼效应，正如霍夫描述的那样（霍夫曼，1985;霍夫曼等人，2019 年）。人类多能干细胞也使用高水平的蛋氨酸进行蛋白质合成和参与表观遗传调控的甲基化反应。有趣的是，蛋氨酸和SAM是调节多能性和分化的关键因素。蛋氨酸剥夺诱导SAM水平降低，引发表观遗传变化，调节参与多能性的基因表达（Shiraki等人，2014）并使细胞保持静止状态（Homma等人，2022）。我们的结果显示精氨酸甲基转移酶PRMT2的消耗和sDMA的升高表明抗性细胞中的精氨酸甲基化减少。这与先前描述PRMT抑制触发胚胎成纤维细胞的Oct4依赖性重编程的结果非常吻合，这意味着抑制蛋白质精氨酸甲基化可能是重编程过程的电感（Yuan等人，2011）。

总之，我们的结果表明，耐药性前列腺癌细胞处于代谢休眠状态，显示出抑制脂肪酸氧化，蛋氨酸和ADP-核糖基化途径。根据之前的假设（Shyh-Chang和Ng，2017），似乎长期自我更新的干细胞在缺氧环境中保持其多能能力并下调线粒体活性（Han等人，2018）。此外，有人提出，在应激条件下，癌细胞可以经历从增殖状态到休眠状态的表型转变，其特征是无增殖、无死亡、无衰老、对化疗耐药、休眠标志物高表达、代谢抑制和恢复到活动状态（莫拉莱斯-瓦伦西亚和大卫，2022 年).事实上，肿瘤休眠是癌症发展的关键阶段，癌细胞可以保持隐匿性、无症状和对治疗的抵抗力。肿瘤休眠细胞限制了化疗的疗效，化疗主要针对高度分裂的细胞，导致复发和耐药性。肿瘤细胞保持休眠并显着重新出现的能力，对化疗具有更积极的抵抗力，这是前列腺癌的特征（Cackowski 和 Heath，2022 年）。尽管肿瘤休眠在前列腺癌的化疗耐药性中很重要，但休眠进入的机制和所涉及的代谢途径在很大程度上仍未得到探索。在这项研究中，我们探索了对化疗耐药的前列腺癌细胞的代谢适应。研究结果表明，Nanog的过表达与前列腺癌细胞休眠有关（Cackowski等人，2017）。同样，Zhang等人之前的一项研究表明，Nanog过表达诱导结直肠癌细胞休眠（Zhang等人，2022）。因此，我们的结果表明，化学耐药性与Nanog的过表达和代谢关闭有关。这些结果揭示了支持癌细胞进入休眠状态的途径。然后，克服化学耐药性的策略可能是通过重新连接在耐药细胞中保持下调的代谢途径来诱导休眠逃逸。

代谢组学的主要限制之一是鉴定未知代谢物。代谢物的鉴定通常不是一项成功的任务，并且通常只能明确鉴定少数代谢物。造成这个问题有两个原因，一是费用过高或大多数标准不可用，二是在现有数据库中可以找到的信息有限。另一个强大的限制是缺乏能够完全覆盖代谢组的分析平台，这是由于分析样品中可能存在的广谱代谢物的异质性以及这些代谢物丰度的差异，因为它们的范围可能从pmol到mmol（九个数量级）。另一方面，该研究的另一个局限性是我们使用了独特的抗性细胞系。尽管这使得样品的均匀性在代谢组学分析中达到更好的准确性，但使用耐药细胞系与另一种不同的化疗药物相比，这项工作可能会获得额外的相关性。