编码纳米抗体的mRNA联合IgG抗体可预防艰难梭

基于驼类来源的VHH，研究者设计了一种靶向艰难梭菌毒素TcdA和TcdB的多价纳米中和抗体（VNAs, VHH-ba[x]sed neutralizing agents）mRNA序列，向小鼠体内静脉注射编码纳米抗体的VNA-mRNA-LNP，在血清中可检测到足够水平的纳米中和抗体，以保护小鼠免受毒素攻击后的严重疾病进展。

他们还同时构建了一种编码效应抗体的EfAb-mRNA-LNP，旨在与纳米中和抗体特异性表位结合，以延长其血清半衰期。共同注射VNA-mRNA-LNP和EfAb-mRNA-LNP或者重组抗体EfAb时，均可增加小鼠和悉生猪仔血清VNA半衰期。在攻毒模型中，VNA血清半衰期的延长与较高浓度的血清VNA及小鼠预防保护效应的增强密切相关。总之，这些研究证实基于mRNA-LNP技术的双组分纳米抗体+效应抗体的治疗潜力。

一、研究背景

1.1 纳米抗体的优劣势常规的IgG抗体是一种大分子免疫球蛋白，分子量为150KDa，由4条肽链组成Y形结构，分别包括2条轻链和2条重链。1989年，科学家在骆驼科动物体内发现一种天然缺失轻链的重链抗体，这种重链抗体的可变区只有15KDa，是常规抗体分子质量的1/10，其蛋白质晶体结构长度为4 nm，直径为2.5 nm，称之为纳米抗体。与常规抗体相比，作为小型、紧密压缩、二硫键稳定的蛋白质，纳米抗体在多种宿主中可以更好地重组表达，并且比 mAb 更能抵抗极端温度或 pH 值。单个或者多聚体的VHH能保留生物学功能，并且，多聚体纳米抗体可显示出更好的亲和力和效力。

但VHH有个的缺点，那就是缺乏抗体Fc结构域，因此其血清半衰期短，缺乏抗体效应功能，例如，促进病原体调理功能、抗体依赖的细胞毒作用或者补体激活。融合宿主特异性 Fc 区或其他血清丰富的蛋白质（例如白蛋白）可有效改善VHH的血清半衰期，并赋予其额外的生理学功能。然而，这些复杂的重组融合蛋白的表达通常需要更昂贵的真核宿主系统来促进正蛋白质的正确折叠以及糖基化修饰。

1.2 纳米抗体在艰难梭菌感染中的应用

艰难梭菌是一种厌氧革兰氏阳性细菌，艰难梭菌在肠道中过度增殖并释放毒素会导致从轻度自愈性腹泻到危机生命的肠膜炎等一系列临床症状。据CDC统计，在2019年，美国约有 20 万感染病例和近 13,000死亡病例。TcdA 和 TcdB是艰难梭菌的两种主要毒力因子。塔夫茨卡明斯兽医学院传染病与全球健康系Charles Shoemaker教授曾经开发了一种异源四聚体纳米抗体（VNA2-Tcd），由两个分别靶向TcdA或者TcdB的双特异性纳米抗体组成，在各种艰难梭菌感染动物模型中均非常有效。

1.3 mRNA技术或可弥补纳米抗体的缺陷LNP具有天然肝靶向性，静脉注射mRNA-LNP后，宿主肝细胞立即成为蛋白质生产的主要来源。mRNA-LNP技术不仅可应用于疫苗开发，还可应用于基于蛋白质的多种疗法。例如，基因编辑、抗体生产及罕见病治疗等领域。

基于mRNA技术编码任意蛋白的特征，研究者设想，利用 mRNA-LNP在体内表达靶向TcdA和TcdB两种抗原的纳米抗体，是否可以作为艰难梭菌感染的候选治疗方案？

二、构建靶向艰难梭菌毒素的纳米抗体mRNA

2.1 纳米抗体mRNA的体外表征研究人员根据此前报道过的肉毒梭菌毒素纳米抗体（VNA-BoNTA）的mRNA序列，构建了编码靶向艰难梭菌毒素（TcdA和TcdB）的纳米抗体VNA-mRNA序列，其由两个靶向非重叠毒素表位的VHH、一个信号肽（SP）、两个O-tag标签和一个羧基末端鼠白蛋白结合肽（ABP）组成。此外，他们设计了一种编码TcdA/B异源四聚体纳米抗体的mRNA序列，包括来自TcdA-VNA的两个重链可变区和来自TcdB-VNA的两个重链可变区。将上述构建好的VNA-mRNA转染BHK细胞（仓鼠肾细胞），WB图谱显示mRNA编码的3种类型的艰难梭菌毒素纳米抗体主要表达于细胞上清液中。将细胞上清液进行5倍梯度稀释，利用O-Tag标签特异性的ELISA检测证实其靶标结合的特异性。艰难梭菌毒素触发细胞形态变圆的现象可以用于艰难梭菌感染的诊断和研究。在Vero细胞中检测mRNA编码的艰难梭菌毒素纳米抗体功能，发现VNA-TcdA、VNA-TcdB及VNA-TcdA/B均可防止毒素引发的Vero细胞形态变圆。

2.2 纳米抗体mRNA的体内表征使用LNP包封mRNA，并注射到小鼠体内，在不同时间点通过O-Tag标签特异性的ELISA定量检测VNA血清滴度。结果显示，VNA-TcdB血清滴度是高的，所有mRNA-LNP编码的VNA血清滴度均在注射后前两天达到峰值，在第4天发生下降，在第7天仅可略微检测到。

单次静脉注射10μg的VNA毒素纳米抗体mRNA-LNP 24小时后，再次注射25ng TcdA或TcdB毒素进行攻毒试验（致死剂量），对细菌毒素引起的毒血症相关症状进行评估。注射VNA-TcdA、VNA-TcdB或者VNA-TcdA/B的小鼠出现轻度或中度临床症状，通常在2天内消退。所有注射VNA-BoNTA（肉毒梭菌毒素纳米抗体）的小鼠在受到任何一种毒素攻击时都出现了严重的毒血症症状。这些数据证实mRNA-LNP 编码的纳米抗体在体内发挥出应有的抗毒素功能。

三、构建靶向亲和标签的效应抗体mRNA

纳米抗体VNA在小鼠中的血清半衰期仅为1-2小时，添加ABP（白蛋白结合肽）， 可将血清半衰期延长至约一天。为了进一步改善纳米抗体血清半衰期并增加Fc效应功能，研究人员构建了高亲和力大鼠抗O-Tag标签的mAb作为效应抗体（EfAb），其能与VNA纳米抗体上的O-Tag标签表位特异性结合。研究人员将此抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）嵌入到人IgG1框架中。为了优化蛋白质表达，在本项研究中，研究者选择编码重链（HC）和轻链（LC）的mRNA比例为1.2：1。

根据过往研究结果，研究者将EfAb-mRNA-LNP在小鼠体内的注射剂量设定为2.5μg~40μg，而将重组抗体EfAb的注射剂量设定为10μg~250μg。在小鼠模型中，当EfAb-mRNA-LNP注射剂量增加4倍时，EfAb表达水平增加4倍以上，也就是说EfAb-mRNA-LNP注射剂量与其表达出来的EfAb呈现一条超线性曲线。相反，重组抗体EfAb的注射剂剂量与其对应的血清水平呈现密切的线性关系。在注射VNA-mRNA-LNPs24小时后，研究者观察到类似的超线性血清VNA剂量曲线。有趣的是，在非人灵长类动物中没有观察到静脉注射后的这种超线性剂量反应。

基于上述研究结果，研究人员预估10 μg EfAb-mRNA-LNP或100 μg重组抗体EfAb与2.5μg VNA-mRNA-LNP共同给药后，血清EfAb水平足以结合血清VNA上存在的所有O-Tag标签。

四、效应抗体联合给药的测定

4.1 效应抗体联合给药，延长纳米抗体半衰期将2.5μg的VNA-TcdB-mRNA-LNPs与100μg鼠源重组抗体EfAb或10μg 人源EfAb-mRNA-LNP共同注射到小鼠体内。在没有注射鼠源重组抗体EfAb的情况下，VNA-TcdB的血清滴度在7天后会下降到其初始峰值水平的约1%；相反，与鼠源重组抗体EfAb共同给药的情况下，VNA-TcdB血清滴度注射第7天时仍然保持在峰值水平的50%左右。

当共同注射人源化EfAb-mRNA-LNP和VNA-TcdB-mRNA-LNPs时，只有一部分小鼠表现出与使用鼠源重组蛋白EfAb观察到的类似的血清半衰期延长现象。研究者证实这种血清半衰期延长异质性的现象是由于抗药物抗体（anti-drug-antibody,ADA）触发的，也就是说如果不让机体对VNA和EfAb进行脱敏，那么针对VNA和EfAb的ADA反应可以在一些小鼠给药后约一周迅速激活，严重降低这些药物的血清半衰期。4.2 效应抗体联合给药，增强纳米抗体预防小鼠中毒效果

研究人员发现，在攻毒试验后（毒素剂量为初始攻毒试验的2倍），仅仅注射VNA-TcdA或VNA-TcdB mRNA-LNP要比共同注射EfAb-mRNA-LNP的小鼠表现出更加严重的中毒迹象。尽管接受EfAb共同注射的小鼠症状相对较轻，在毒素攻击后没有发生死亡，而所有缺乏EfAb的小鼠在TcdA攻击下发生死亡（5/5）。在TcdB攻击下，所有缺乏EfAb的小鼠出现了更严重的临床症状，并且，两只老鼠出现死亡（2/5）。研究人员在5只临床症状非常严重的小鼠血清中检测不到VNA或EfAb水平，这说明ADA效应会导致纳米抗体的抵御毒素的保护效应受到严重降低。综上所述，在不触发ADA效应的情况下，EfAb共表达增强纳米抗体预防小鼠发生严重中毒的治疗窗口时间。

4.3 效应抗体联合给药，增强仔猪模型中纳米抗体血清滴度和半衰期为了在更适合人类肠道疾病研究的大型动物模型中确认EfAb对VNA-TcdB的血清滴度和半衰期的影响，研究人员在悉生仔猪模型中检测纳米抗体药代动力学特征（PK）。在仔猪模型中，VNA-mRNA编码的纳米抗体上的鼠ABP组分不会结合猪白蛋白。因此，在没有EfAb存在的情况下，VNA-mRNA编码的纳米抗体在血清中的滴度具备其天然药代动力学特征。将VNA-TcdB-mRNA-LNP和EfAb-mRNA-LNP共注射到仔猪体内，在注射后第一天，VNA-TcdB血清滴度到达到峰值，并在第5天扔保持在峰值水平。在注射5天后，VNA-TcdB和EfAb血清滴度开始稳步下降，这两组蛋白的血清半衰期均为一周。当在猪仔体内只注射VNA-TcdB-mRNA-LNP时，即便注射剂量是共注射时的5倍之高，VNA-TcdB血清滴度峰值仍然要比与EfAb共注射时低。而且，随着时间的增加，VNA-TcdB血清滴度快速下降。此外，用对照组mRNA-LNP代替EfAb-mRNA-LNP共同给药会导致VNA-TcdB血清滴度峰值水平降低十倍。

总之，共注射EfAb可提升仔猪模型中VNA-TcdB的血清丰度和半衰期。

五、小结

这项研究的大创新之处在于，研究者利用mRNA-LNP技术，成功地在体内表达了异源多聚体的纳米抗体。并且，通过共注射编码效应抗体的mRNA（这些效应抗体可以通过亲和标签与靶向毒素的纳米抗体结合），实现了血清中靶向毒素的纳米抗体的丰度和半衰期的提高，从而增强了纳米抗体预防小鼠发生严重中毒症状的效力。此外，还需要特别注意ADA效应，以防止对纳米抗体和效应抗体的血清滴度产生严重影响。对于效应抗体而言，可能只需使用经过修饰的IgG来降低免疫原性，这种修饰已经被广泛用于减少IgG治疗剂对人类和兽医动物的免疫原性。总之，这项研究对于探索基于mRNA技术的纳米抗体应用、以及如何改善纳米抗体的血清半衰期，具有非常重要的借鉴意义。