BRWD3调控KDM5活性以维持H3K4甲基化水平的表观机制

组蛋白修饰对调控染色质结构和基因表达至关重要，组蛋白修饰失调可能导致疾病状态和癌症。染色质结合蛋白BRWD3（Bromodomain and WD repeat-containing protein 3）是Cul4-DDB1 E3泛素连接酶复合体的已知底物特异性因子，敲除BRWD3会导致H3K4me1（H3 lysine 4 monomethylation）水平增加。然而，连接BRWD3和H3K4甲基化的潜在机制尚不明确。

该研究通过染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）等分析揭示了BRWD3促进组蛋白去甲基化酶 5(lysine-specific demethylases 5,KDM5)降解以维持H3K4甲基化水平。

标题：BRWD3 promotes KDM5 degradation to maintain H3K4 methylation levels（BRWD3促进KDM5降解以维持H3K4甲基化水平）

时间：2023-09-26

期刊：Proceedings of the National Academy of Sciences

影响因子：IF 11.1

技术平台：ChIP-seq、ChIP-qPCR、RNA-seq等

研究摘要：

本研究结果显示BRWD3敲除不仅会导致H3K4me1水平增加，还会导致H3K4me 水平降低，表明BRWD3对H3K4甲基化的影响具有广泛性。通过免疫沉淀结合定量质谱分析鉴定出BRWD3与H3K4特异性组蛋白去甲基化酶5（KDM5/Lid）之间的相互作用，KDM5是一种从H3K4中去除三甲基和二甲基标记的酶。此外染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)数据分析显示，BRWD3和KDM5在全基因组中共定位，且H3K4me3在BRWD3结合位点高度富集。BRWD3促进K48连接多泛素化和KDM5降解，并且KDM5降解依赖于BRWD3和Cul4。而敲除KDM5完全恢复改变的H3K4me3水平，部分恢复BRWD3敲除后的H3K4me1水平。总之本研究结果表明，BRWD3调节KDM5活性以维持H3K4甲基化水平。

研究方法：

研究结果：

（1）BRWD3影响H3K4单甲基化、二甲基化和三甲基化水平

·             胚胎的BRWD3-HA IP的质谱分析流程。

·             BRWD3-IP-TMT-MS火山图结果。蓝点表示与阴性对照相比BRWD3-HA-IP富。红点表示Cul4-DDB1-BRWD3 E3泛素连接酶复合体。

·             BRWD3和KDM5 ChIP-seq轨迹相似性的代表性视图（左）。Venn图量化基因组上BRWD3和KDM5结合位点之间的重叠，P＜0.0001（右）。

（3）BRWD3促进KDM5泛素化和降解

·             BRWD3-V5共转染（OE）、野生型（WT）或BRWD3-RNAi（KD）条件下，HA标记的KDM5和/或FLAG标记的泛素共转染的果蝇S2细胞的Denaturing IP分析。

·             Denaturing IP的免疫沉淀用K48-或K63-连接的多泛素链特异性抗体与抗HA抗体进行联合印迹分析。

·             用表达KDM5-HA的质粒转染S2细胞，并用环己酰亚胺（CHX）单独或与蛋白酶体抑制剂MG-132联合处理。经CHX处理指定时间后，用抗HA抗体进行western blots检测KDM5-HA水平。

·             与C类似，但分别使用BRWD3 RNAi或GFPi RNAi处理。

·             在指定时间点对（D）的三个生物学重复进行KDM5-HA水平定量，归一化为总负载蛋白水平。

·             与C类似，用GFPi-RNAi、Cul4-RNAi或Cullin抑制剂（MLN4924）处理S2细胞。

·             在指定时间点对来自F的三个生物学重复的剩余KDM5-HA水平进行定量分析。

（4）抑制KDM5可以恢复在BRWD3敲除后改变的H3K4me3水平

B. 使用抗H3K4me3抗体（A）或抗H3K4me1抗体（B）在果蝇S2细胞中进行定量IF检测的小提琴图。在共敲除中使用了5微克的KDM5 dsRNA。每个分布表示从三个生物学重复中随机选择的1000个细胞的信号强度，使用单因素方差分析和Tukey多重比较检验，****P＜0.0001。

C. BRWD3单个拷贝的缺失导致了依赖于KDM5的Su（var）表型。

D. BRWD3依赖性调控H3K4甲基化水平模型。BRWD3靶向KDM5降解。在BRWD3缺失情况下，KDM5活性增加，导致H3K4me3去甲基化，从而促进H3K4me1水平升高。

研究意义：

H3K4甲基化与基因转录活性相关，但调控H3K4me3水平的机制尚不清楚。本研究分析了BRWD在调控H3K4甲基化中的作用，BRWD3是一种染色质结合蛋白和Cul4DDB1泛素连接酶复合体的底物特异性因子。分析结果显示BRWD3敲除不仅会增加H3K4me1水平，而且还会降低H3K4me3水平。BRWD3与KDM5/Lide（KDM5/Lid是一种主要去除H3K4三甲基和二甲基标记的去甲基化酶）的结合，BRWD3可以通过K48连接多泛素化促进KDM5降解，KDM5共敲除可恢复与BRWD3缺失相关的H3K4me3水平。本研究结果表明BRWD3是调控H3K4甲基化水平维持的关键因子。